Kombinatoriske genetikkmetoder for å oppdage høyordens regulatoriske kombinasjoner og ingeniørgenetiske drivere for nevral differensiering

Dykk inn i søket etter effektive celledifferensieringsfaktorer

Forskere streber fortsatt etter å finne bedre terapi for å snu eller bremse utviklingen av nevrologiske lidelser som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og Huntingtons sykdom. Disse lidelsene er et resultat av nevronal celledød i forskjellige deler av hjernen. Medisiner eller behandlinger som brukes for å lindre symptomene hos pasienter er ikke godt etablert.

Klikk for å cistanche tubulosa-pulver for nevrobeskyttelse

De gjenoppretter ikke det skadede nevrale vevet og kan føre til uønskede bivirkninger. Derfor ser et økende antall studier på stamceller som et lovende terapeutisk middel, på grunn av deres selvfornyende evner og fleksibilitet til differensiering til ønskede cellelinjer for innpodning i pasienten for å gjenopprette tapt nevrale vev.

Men før stamceller kan brukes klinisk i behandling av nevrologiske lidelser, er det fortsatt områder som krever en bedre forståelse for å frigjøre deres fulle potensial. Stamceller er regenerative og formbare, med tilbøyelighet til å bli en hvilken som helst celletype gitt den rette sammensetningen av faktorer for å drive differensiering. Det er imidlertid en dybde av kompleksitet i det store nettverket av faktorer.

Det er viktig å bestemme kombinasjonene av transkripsjonsfaktorer (TF), små molekyler og/eller vekstfaktorer for å oppnå optimal synergisme for å differensiere stamceller, inkludert embryonale stamceller (ESCs) og induserte pluripotente stamceller i raskest mulig hastighet, noe som resulterer i i den reneste populasjonen av en nevronal avstamning. Det kan imidlertid være en strategisk måte å screene for disse faktorene på en mer kostnadseffektiv og tidseffektiv måte.

Dette vil bidra til å optimalisere de allerede etablerte protokollene som fortsatt er arbeidskrevende eller for ytterligere karakterisering av nevronale undertyper som medium spiny nevroner, sensoriske nevroner og serotonerge nevroner. Det er fortsatt en utfordring å profilere driverne for nevronal skjebne på en omfattende måte og definere hvordan disse elementene samhandler med hverandre i det regulatoriske nettverket.

Noen få grupper har brukt nye screeningtilnærminger med høy gjennomstrømning for å belyse det regulatoriske nettverket av celleskjebne og gitt informativ innsikt om faktorer som driver nevronal konvertering og overlevelse. Liu et al. (2018) brukte CRISPR-aktivering (CRISPRa) for å søke etter TF-er eller DNA-bindende faktorer som fremmer den neuronale skjebnen til ESC-er. Arbeidet var imidlertid begrenset til å studere enkeltfaktorer eller parvise kombinasjoner.

En annen systematisk screening ble utført av Tsunemoto et al. (2018), som undersøkte forholdet mellom TF-er. De fleste av deres utvalgte enkelt-TF viste ingen effekter i studien, men de identifiserte 76 parvise TF-kombinasjoner for å fremme differensieringen av musefibroblaster til induserte nevroner.

Spesielt manglet resultatene deres en viss konsistens med tidligere studier, for eksempel å ikke oppdage den dopaminaktive transportøren Slc6a3 i induserte nevroner, muligens på grunn av å gå glipp av flere faktorer. En annen studie bestemte de essensielle genene for å opprettholde eller forbedre overlevelsen til nevroner ved å utføre en CRISPR-interferens (CRISPRi)-basert screening (Tian et al., 2019). Og igjen, de var begrenset til screening av enkelt sgRNA.

Ytterligere studier kreves for en objektiv screening for andre genetiske faktorer, og for å øke antall faktorkombinasjoner, ettersom det har vist seg at en cocktail av mer enn to faktorer kan være nødvendig i forskjellige sammenhenger for å effektivt drive differensiering og omprogrammering.

Et godt eksempel er kombinasjonen av Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc som er nødvendig for å regulere utviklingssignalnettverket for pluripotensen til ESC-er (Takahashi og Yamanaka, 2006). I slike komplekse systemer er det behov for å karakterisere funksjonene til høyordens genetiske kombinasjoner på en måte med høy gjennomstrømning, og Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) metode kan kanskje bare gjøre det.

CombiGEM-metode for en høy gjennomstrømning, høy orden og systematisk skjerming av faktorkombinasjoner

CombiGEM tilbyr ikke bare en systematisk måte å utføre sammenslåtte skjermer i stor skala på, men har også muligheten til skalerbar sammenstilling av høyordens kombinatoriske genetiske biblioteker (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). One-pot-prosessen lar brukeren screene for en rekke genetiske kombinasjoner; 1-måte, 2-måte, 3-måte og i teorien n-veis biblioteker.

Dette gir et raskt alternativ til den konvensjonelle prosessen med å bygge og teste individuelle kandidatkombinasjoner av interesse. Mens flere andre kombinatoriske CRISPR-screeningsstrategier også ble utviklet for å studere parvise genetiske kombinasjoner (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020 ), CombiGEM tilbyr en unik mulighet til å evaluere interaksjoner mellom tre eller flere genetiske kombinasjoner.

For eksempel, hvis brukeren har som mål å bruke CRISPRa eller CRISPRi for henholdsvis å overuttrykke eller undertrykke en liste over kandidat-TF-kombinasjoner, kan man screene et strekkodet bibliotek med TF-målrettede sgRNA-kombinasjoner ved å bruke CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020) som illustrert i figur 1.

Ved å bruke one-pot ligeringstrinn blir biblioteket av sgRNA og deres respektive strekkoder inkorporert i en lentiviral-destinasjonsvektor som rapporterer ekspresjonen av et fluorescerende protein ved aktivering av en nevroncelletypespesifikk promoter, slik som tubulin 1. Biblioteket av sgRNA og en separat lentiviral vektor som huser den enzymatisk mangelfulle Cas9, enten smeltet sammen med en transkripsjonsaktivator eller repressor, kan leveres inn i de ønskede startcellene.

Over tid, når cellene begynner å differensiere, vil bare induserte nevronlignende celler uttrykke fluorescens, og disse cellene kan isoleres ved å bruke fluorescensaktivert cellesortering for å hente deres husende TF-kombinasjoner via strekkodesekvensering.

For å få en bedre forståelse av kombinasjonene som driver spesifikke cellelinjer, kan disse cellene også undersøkes for kjente cellelinjereportere eller markører basert på preferansen til differensieringsstadier brukeren velger å studere. Magnetisk-aktivert cellesortering kan brukes til å skille celler av interesse avhengig av celleoverflatemarkøruttrykkene.

Enkeltcelle-RNA-sekvensering kan kobles til den kombinatoriske CRISPR-screeningen som en avlesning for å profilere typen og nivåene av genopp- eller nedregulering, og kombinasjonen av målrettede TF-er kan bestemmes via strekkodelesingene (Replogle et al., 2020). Høyinnholdsavbildning kan brukes til å overvåke cellemorfologiendringene fra de tidlige til senere stadier av nevronutvikling.

Den fysiologiske relevansen eller funksjonaliteten til de induserte nevronlignende cellene kan bestemmes ved immuncytokjemisk merking spesifikk for nevronmodning, slik som NeuN, TUJ1 og MAP2, og elektrofysiologiske tiltak. Som nevnt tidligere har studier kombinert TF og små molekyler for å manipulere celleskjebne.

CombiGEM kan også brukes til å identifisere små molekylkombinasjoner som kan opprettholde selvfornyelsen av stamceller, indusere cellelinjedifferensiering eller lette omprogrammering ved å øke effektiviteten og potensielt erstatte genetiske faktorer. CombiGEM kan også brukes ved først å bestemme de små molekylmålene til signalveier, epigenetiske eller cellulære prosessfaktorer.

Deretter ved å designe et bibliotek med sgRNA for å aktivere eller inaktivere de medisinerbare målene, kan man deretter identifisere de effektive kombinasjonene av små molekyler for å forbedre differensieringen eller omprogrammeringen. Dette konseptet gjenspeiles godt av studiene vi tidligere har utført for å oppdage medisinmålkombinasjoner mot kreft og Parkinsons sykdom (Zhou et al., 2020).

Bruken av CombiGEM er ikke bare begrenset til CRISPR-baserte forstyrrelser, men kan også brukes på andre DNA- eller RNA-regulatoriske faktorer for å studere tap-av-funksjonsskjermer med RNA-interferens, så vel som gain-of-function med uttrykket av mikroRNA (Wong et al., 2015) og sekvensverifiserte humane åpne leserammer som de som er rapportert i det humane TFome-biblioteket (Ng et al., 2020).

CombiSEAL-metode for high-throughput engineering av transkripsjonsfaktorer

Å finne den ideelle kombinasjonen av naturlig forekommende genetiske faktorer kan fortsatt by på utfordringer, for eksempel å være begrenset til karakteriserte TF-er av genomet med forkunnskap om deres uttrykk og roller i differensiering. Studier har vist at engineering av TF-er eller generering av kunstige transkripsjonsfaktorer åpner for en ny vei med alternativer for å øke hastigheten på differensiering gjennom alternative veier, overgå avhengigheten av forutsetningsekspresjon av andre endogene kofaktorer i det genregulerende nettverket, eller helt erstatte naturlige TF-er med mer effektive (Jauch, 2018).

Dette gjør forskerne i stand til å skreddersy de nødvendige faktorene i henhold til deres eksperimentelle behov. Vi foreslår at hvis man har som mål å utføre mutagenese med høy gjennomstrømning på flere steder til en TF som omfatter forskjellige domener, kan CombiSEAL vise seg å være en nyttig plattform (Choi et al., 2019). CombiSEAL-metoden setter sammen aminosyrekodende DNA-fragmenter som er kombinatorisk merket med strekkoder (Figur 1).

Figur 1 ｜ CombiGEM og CombiSEAL metoder for å screene for effektive genetiske drivere for differensiering. Et eksempel på CombiGEM-metoden er sammenstillingen av flere sgRNA-er uttrykt fra samme konstruksjon, og sgRNA-kombinasjonene er representert av deres sammenkoblede strekkoder. CombiSEAL-metoden omfatter mutasjoner introdusert til ulike deler av et protein, slik som transkripsjonsfaktorer, indikert som P1, P2, P(n) og P(n pluss 1). Og kombinasjonene av mutasjoner reflekteres av deres tilsvarende sammenkjedede strekkoder. Brukeren kan bruke oppsettene til andre DNA-leveringssystemer, og i denne representasjonen brukes lentivirale vektorer. Screeningstrategier kan utføres i et samlet format, og i dette eksemplet blir identifisering av cellepopulasjoner som differensierer til en spesifikk nevronlinje oppdaget ved aktivering av promoteren for fluorescerende proteinuttrykk, merket som X-fluorescens i diagrammet. Neste generasjons sekvensering (NGS) av strekkodene fra cellepoolen vil dechiffrere DNA-målene eller transkripsjonsvarianten(e). Stringent analyse av faktorer som driver differensieringen av forskjellige nevrontyper kan bruke array-baserte metoder som sondering av celler med cellelinjemarkører etterfulgt av magnetisk-aktivert cellesortering (MACS) i multi-brønns plater, som kan følges opp med bildebehandling med høyt innhold. Alternativt lar encellet RNA-sekvensering (RNA-Seq) brukeren profilere genuttrykkene til celler med de ønskede fenotypene og vil være i stand til å hente strekkodene for å identifisere sgRNA-kombinasjoner eller mutasjonskombinasjoner av nøkkelvarianten(e). FACS: Fluorescensaktivert cellesortering.

CombiSEAL begynner med de første seksjoneringsdelene av proteinet der mutagenese er ønsket. Brukeren kan generere et hvilket som helst antall varianter for hver seksjon, og deretter merke dem med strekkoder for å identifisere posisjonen og kombinasjonen av mutasjoner. Hver samling av seksjoner settes deretter sammen sekvensielt ved å sette dem inn i en destinasjonsvektor som inneholder villtype-proteinsekvensen modifisert med flankerende type IIS-enzymer i området for tiltenkt mutagenese.

Dette arrløse fusjonsskjemaet for å koble sammen flere deler av et protein er viktig for å unngå å legge til uønskede aminosyrer til proteinet. CombiSEAL-metoden gjør det mulig å bestemme aminosyresekvensene til det utvalgte utvalget av varianter av interesse mer effektivt og kostnadseffektivt, og unngår behovet for langlest sekvensering over hele proteinet for å identifisere typene av mutasjoner og hvor de befinner seg på tvers av protein.

Dette metodiske oppsettet tillater enklere analyse ved å utføre en sekvensering med høy gjennomstrømning av utvalget av korte sammenkoblede strekkoder som utleder kombinasjonen av typer og posisjoner av aminosyremutasjoner, eller andre ønskede modifikasjoner som domenebytte, innsetting og sletting, som hadde blitt opprinnelig designet og installert på TF

Konklusjon

Sammenlignet med prøving-og-feil-metoder, har det blitt gjort fremskritt med å bruke mer systematiske tilnærminger for å bestemme de essensielle faktorene eller kombinasjonene som kreves for å drive konverteringen av en celletype til en nevronal avstamning. Imidlertid har evnen til å identifisere kombinasjoner av høyere orden manglet, og her foreslår vi at CombiGEM-metoden kan være i stand til å adressere slike begrensninger.

CombiGEM bruker et strekkodet ligeringssystem med én pott for å sette sammen høyere ordens kombinasjoner av DNA-bindingsfaktorer til mål-DNA på én gang, og omgår prosessen med flere runder med screening for å begrense antallet treff til en håndterbar størrelse for nedstrømsvalideringer . Videre kan mindre effektive naturlige TF-er erstattes med kunstige eller konstruerte TF-er for bedre å regulere genuttrykk. Vi beskriver en proteinmutagenesemetode, CombiSEAL, som vil gjøre det mulig for brukere å lage store bassenger av transkripsjonsfaktorvarianter ved å enkelt sette sammen flere stedsmutasjoner merket med strekkoder innenfor proteinet og deres forskjellige domener.

Dette vil fremskynde og senke kostnadene ved screeningsprosedyrer for å hente informasjon om typene mutasjoner av variantene av interesse. Vi håper at de foreslåtte metodene kan hjelpe med ytterligere forståelse og utvidelse av mulighetene for å fremme nevrale regenerering og kan være allment anvendelige på andre forskningsområder.

Mekanismen for Cistanche nevrobeskyttende effekt

Cistanche har vist seg å ha nevrobeskyttende effekter gjennom flere mekanismer:

1. Antiinflammatoriske effekter: Cistanche inneholder forbindelser som har vist seg å hemme betennelse i ulike deler av hjernen, noe som kan bidra til å beskytte nevronene mot skade.

2. Antioksidanteffekter: Cistanche inneholder forbindelser som har sterke antioksidantegenskaper. Antioksidanter bidrar til å beskytte nevroner mot skade forårsaket av frie radikaler og oksidativt stress.

3. Regulering av nevrotransmittere: Cistanche har vist seg å regulere visse nevrotransmittere, som serotonin og dopamin, som kan bidra til å beskytte nevroner og forbedre kognitiv funksjon.

4. Neurotrofisk faktorstimulering: Cistanche har vist seg å stimulere produksjonen av nevrotrofiske faktorer, slik som hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF), som kan fremme vekst og overlevelse av nevroner.

Samlet sett jobber disse mekanismene sammen for å beskytte nevroner mot skade, fremme deres vekst og overlevelse og forbedre kognitiv funksjon.

Referanser

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Kombinatorisk mutagenese optimaliserer i stor grad genomredigeringsaktivitetene til SpCas9. Nat Methods 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optimalisering av AsCas12a for kombinatoriske genetiske skjermer i menneskelige celler. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Synergistiske medikamentkombinasjoner for kreft identifisert i en CRISPR-skjerm for parvise genetiske interaksjoner. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Omprogrammering av celleskjebne gjennom utvikling av native transkripsjonsfaktorer. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Cas9-enzymer for kombinatoriske genetiske skjermer. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et al. (2020) Et omfattende bibliotek med menneskelige transkripsjonsfaktorer for celleskjebneteknikk. Nat Biotechnol doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Kombinatoriske encellede CRISPR-skjermer ved direkte guide RNA-fangst og målrettet sekvensering. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, et al. (2017) Kombinatoriske CRISPRCas9-skjermer for de novo kartlegging av genetiske interaksjoner. Nat Methods 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induksjon av pluripotente stamceller fra mus embryonale og voksne fibroblastkulturer ved definerte faktorer. Celle 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) CRISPR interferensbasert plattform for multimodale genetiske skjermer i human iPSC -avledede nevroner. Neuron 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai for samtidig genaktivering og hemming for å fremme stamcellekondrogenese og calvarial beinregenerering. Nucleic Acids Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Massivt parallell høyordens kombinatorisk genetikk i humane celler. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) Multipleks strekkodet CRISPR-Cas9-screening aktivert av CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) En treveis kombinatorisk CRISPR-skjerm for å analysere interaksjoner mellom medisinerbare mål. Cell Rep 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*