Deteksjon og karakterisering av mineralo-organiske nanopartikler i menneskelige nyrer

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Ektopisk forkalkning er assosiert med forskjellige menneskelige sykdommer, inkludert aterosklerose, kreft,kronisknyresykdom, ogdiabetesmellitus. Selv om mineralnanopartikler har blitt oppdaget i forkalkede blodkar, er arten og rollen til disse partiklene i menneskekroppen fortsatt uklare. Her viser vi for første gang det mennesketnyrevev hentet fra sluttstadietkronisknyresykdomeller nyrekreftpasienter inneholder runde, multilamellære mineralpartikler på 50 til 1500 nm, mens ingen partikler er observert i friske kontroller. Mineralpartiklene finnes hovedsakelig i den ekstracellulære matrisen som omgir de kronglete tubuli, samlekanaler og løkker til Henle, så vel som i cytoplasmaet til tubuli-avgrensende celler, og består av polykrystallinsk kalsiumfosfat som ligner på mineralet som finnes i bein og ektopiske forkalkninger. Denyremineralnanopartikler inneholder flere serumproteiner som hemmer ektopisk forkalkning i kroppsvæsker, inkludert albumin, fetuin-A og apolipoprotein A1. Siden de mineral-organiske nanopartikler ikke bare finnes i forkalkede forekomster, men også i områder uten mikroskopiske forkalkninger, indikerer våre observasjoner at nanopartikler kan representere forløpere til forkalkning og nyrestein hos mennesker.

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopisk forkalkning er assosiert med aterosklerose, kreft,kronisknyresykdom, og diabetes mellitus1–3. Nyere studier tyder på at åreforkalkning ogkronisknyresykdompasienter med tegn på vaskulær forkalkning viser økt sykelighet og dødelighetsrisiko, noe som tyder på at ektopisk forkalkning er skadelig for menneskers helse1,3. Uønsket forkalkning er også observert hos aldrende individer og de fleste over 60 år viser tegn på vaskulær forkalkning4. Av disse grunner er viktige mål å dechiffrere faktorene som induserer ektopisk forkalkning og utvikle effektiv behandling.

Ektopisk forkalkning kan defineres som en ubalanse mellom inhibitorer og indusere av forkalkning i kroppen. Forkalkningshemmere inkluderer serumproteiner som albumin, fetuin-A, osteopontin og matrise GLA-protein, så vel som små forbindelser som pyrofosfat, mens hyperfosfatemi og betennelse representerer viktige indusere av forkalkning5–7. Nyere studier indikerer at forkalkningsindusere aktiverer en cellulær prosess som ligner på beindannelsen under vaskulær forkalkning7,8. Matrisevesikler som ligner på de som induserer mineralisering i skjelett under utvikling, er også påvist i forkalket bløtvev7–9. Disse matriksvesiklene frigjøres sannsynligvis av vaskulære glatte muskelceller som differensierer til osteoblastlignende celler, som induserer forkalkning7.

Mineralnanopartikler (NP) er påvist i bløtvev som viser tegn på ektopisk forkalkning. Price et al. fant at serum fra rotter behandlet med enten bisfosfonatetidronat eller med vitamin D inneholder mineraler-proteinkomplekser som inneholder forkalkningshemmere fetuin-A og matrise GLA protein10,11. Tilsvarende har Jahnen-Dechent et al. observerte at fetuin-A-holdige mineralkomplekser, som ble kalt kalsiproteinpartikler (CPP), kunne påvises i ascitesvæsken til pasienter med forkalkende peritonitt12. En fersk studie av Bertazzo et al. demonstrerte tilstedeværelsen av mineralske NP i aortaklaffene og koronararteriene hos både aterosklerotiske og revmatiske feberpasienter13. Mens studier på dannelsen av mineralpartikler vanligvis har fokusert på det menneskelige kardiovaskulære systemet, er det fortsatt uklart om partiklene kan finnes i andre vev og om disse enhetene spiller en rolle i helse eller sykdom.

Vi observerte tidligere at mineral-organisk NPS spontant dannes i kroppsvæsker hos mennesker og dyr14–28. Disse mineral-NP-ene ble opprinnelig beskrevet som nanobakterier (NB) og ble antatt å være ikke bare de minste cellene på jorden29, men også en mulig overførbar årsak til en rekke sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom, aterosklerose, kreft,nyresteinformasjon, polycystisknyresykdom, og prostatitt30–32. Våre resultater har imidlertid vist at NB faktisk er ikke-levende mineral-NP-er som etterligner vanlige bakterier når det gjelder morfologi, vekst, spredning og subkultur15,18,22. Muligheten for at mineralpartikler som ligner den såkalte NB kan finnes i menneskelig vev og om disse partiklene spiller en rolle i sykdom gjenstår å undersøke.

I denne studien utviklet vi en nanomaterialtilnærming for å oppdage og analysere mineraler-organiske NP-er hos syke menneskernyrevev. Vi viser at nyrevev fra kronisk nyresykdom i sluttstadiet og nyrekreftpasienter inneholder multilamellære mineral-NP-er som ligner på de biomimetiske mineralpartiklene som spontant utfelles i kroppsvæsker in vitro. Resultatene våre avslører kritisk innsikt om den biokjemiske sammensetningen, dannelsesmekanismen og den biologiske funksjonen til disse mineral-organiske partiklene, og de kaster lys over mekanismer for ektopisk forkalkning og initiering av sykdom i menneskekroppen.

Resultater

Vi undersøkte nyrevev kirurgisk fjernet fra menneskelige pasienter med enten sluttstadiet av kronisk nyresykdom (n=2) eller nyrekreft (n=18; se tabell 1; for nyrekreftprøver, fokuserte vi på ikke -kreft del av vevet). Som friske kontroller studerte vi nyrebiopsier hentet fra pasienter med enten traumer eller hematom, men som ikke hadde noen tidligere unormal nyrefunksjon (n=2; tabell 1).

Nyrevev fra friske individer viste normale histologiske trekk, og ingen ektopisk forkalkning ble observert etter von Kossa-farging (fig. 1A, B). På den annen side viste nyrevev hentet fra syke individer og farget med hematoksylin og eosin (H&E) tegn på vevsskade (fig. 2A–C, indikert med piler), og 80 prosent av det syke vevet som ble undersøkt viste mineraliserte avleiringer som avslørt ved von Kossa-farging (fig. 1C–T, fig. 2E,F, forkalkning er synlig som svart materiale angitt med svarte piler; se også tabell 1). Forkalkede avleiringer ble lagt merke til i cortex og medulla, inkludert det ekstracellulære rommet som omgir de distale kronglete tubuli, proksimale convoluted tubuli, samlekanaler og løkker av Henle samt cytoplasma av celler som avgrenser tubuli og kanaler (fig. 1C–T og fig. 2E, F). Det ble ikke påvist noen forkalkning i nyrelegemet (fig. 2D).

For å undersøke naturen til mineralutfellingene, forberedte vi ultratynne nyreseksjoner for observasjon ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM). I prøver som inneholder mikroskopiske mineralforekomster, ble mineralpartikler eller granuler detektert i cytoplasmaet til nyreepitelceller, i den ekstracellulære matrisen under basalmembranen og i lumenet til proksimale og distale kronglete tubuli (fig. 3A, B, partikler er forstørret) i panelene A1–A4 og B1–B4). Mineral-NP-er ble også observert i celler langs løkkene til Henle og samlekanaler (fig. 3C, D, forstørret i panelene C1, C2 og D1). Noen partikler ble funnet i intracellulære vesikler i nyreceller (fig. 3A, panel A1 og A2). Elektronmikroskopi-tilnærmingen som ble brukt her tillot oss også å visualisere det indre av mineralpartiklene; noen partikler inneholdt elektrontette ringer vekslende med lette, elektrongjennomskinnelige lag (fig. 3A, paneler A3 og A4, fig. 3C, panel C1). Flere blodårer, slik som vasa recta renter (de rette arteriene i nyren), vi er omgitt av et stort antall mineralske NP-er (fig. 3D, panel D1). Mineral-NP-er ble derfor funnet på forskjellige steder i alt humant nyrevev som viste tegn på ektopisk forkalkning, mens det ikke ble funnet partikler i de friske kontrollene som ble undersøkt.

Mineralpartiklene som finnes i nyrevev ser ut til å være svært like de mineraloorganiske NP-ene som er beskrevet som spontant dannes i kroppsvæsker i våre tidligere studier15,17 (og som vi har kalt bioner24). For å verifisere denne muligheten forberedte vi mineralske organiske NP-er (eller bioner) ved å bruke en nedbørsmetode som vi tidligere beskrevet15. Denne metoden består i å tilsette utfellende ioner som kalsium og fosfat i et cellekulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium eller DMEM) som inneholder en kroppsvæske som et humant serum (HS), etterfulgt av inkubasjon i cellekulturforhold (se Metoder). Partiklene produsert på denne måten (HS-NPS) var enten sfæriske eller ellipsoide og viste en glatt eller krystallinsk mineraloverflate (fig. 4A–E), lik partiklene beskrevet tidligere i kroppsvæskene22,23 samt i human ascites12 og forkalkede arterier13. Mineralpartiklene var svært like mineral-NP-er eller granuler som ble observert i nyrevev når det gjelder deres generelle morfologi, flerlagsstruktur og overflateegenskaper (fig. 4F–J). Størrelsen på HS-avledede partikler og nyregranulat var også sammenlignbare, og varierte fra 50 til 1500 nm i diameter (fig. 4A–E,F–J). Som nevnt ovenfor var noen nyregranuler omgitt av en lipidmembran, muligens representerende intracellulære lastvesikler eller ekstracellulære membranvesikler (fig. 4H,I, membraner er angitt med piler); slike membranøse strukturer var fraværende i HS-NP-prøver fremstilt in vitro (fig. 4A–E). Disse observasjonene antyder at nyregranulat ligner de mineralo-organiske NP-ene satt sammen i serum.

Ved å bruke utvalgt område elektrondiffraksjonsanalyse, observerte vi at mineralfasen til HS-NPs forberedt in vitro besto av et polykrystallinsk nanomateriale (fig. 4E, innfelt; legg merke til de svake konsentriske ringene). Lignende resultater ble oppnådd for nyregranulat (fig. 4J, innfelt) og for bein og ektopiske forkalkninger som beskrevet i tidligere studier33,35.

Vi studerte den kjemiske sammensetningen av HS-NP og nyregranulat ved bruk av energidispergerende røntgenspektroskopi (EDX). HS-NPs viste store topper av karbon (C), kalsium (Ca), oksygen (O) og fosfor (P) (Fig. 4K), i samsvar med tilstedeværelsen av et kalsiumfosfatmineral. En lav topp av silisium (Si) ble også notert i HS-NPs (fig. 4K), som muligens representerer en mindre partikkelbestanddel. Nyregranuler viste også topper av karbon, kalsium, oksygen og fosfor, noe som tyder på et kalsiumfosfatmineral, sammen med ytterligere topper av silisium og jern (Fe) (fig. 4L). Uran-topper (U) ble tilskrevet uranylacetatet brukt som kontrastreagens under prøvepreparering (tilstedeværelsen av uran i noen prøver av mineralpartikler som nyregranulat og dets fravær i kontrollvevet i fig. 4M kan tilskrives den høye affinitet av uran for fosfat, som rapportert tidligere35). Kontroll EDX-spektra av nyrevev som omgir partiklene viste topper av karbon og oksygen (fig. 4M), noe som tyder på at kalsium og fosfor hovedsakelig ble funnet i mineralpartiklene.

Kalsium:fosfor (Ca:P) forhold mellom HS-NP og nyregranulat varierte fra 0.65 til 1.18. Disse forholdene skiller seg fra den teoretiske verdien på 1,67 observert for støkiometrisk hydroksyapatitt, men er fortsatt innenfor området sett tidligere for kalsiumfosfat- og apatittkrystaller observert ved forskjellige grader av krystallisering15. Sammen bekrefter disse funnene at nyregranulene består av kalsiumfosfat-NP-er.

Ulike proteiner har vist seg å hemme ektopisk forkalkning på en systemisk måte i kroppen36,37. I tillegg antas proteinkoronaen som finnes på overflaten av syntetiske NP-er å bestemme biofordelingen og effekten av partiklene på cellene in vivo38,39. På den annen side forblir proteinsammensetningen til mineralo-organiske NP-er som finnes i humant nyrevev ufullstendig forstått. Vi fant tidligere at albumin, fetuin-A og apolipoprotein-A1 (apo-A1) representerer hovedproteinene som interagerer med mineralo-organiske NP-er dannet i kroppsvæsker17,20. Her brukte vi immunogoldmerking for å undersøke tilstedeværelsen og den ultrastrukturelle plasseringen av disse proteinene i nyregranulat.

Vi brukte polyklonale antistoffer mot humant serumalbumin (HSA), humant serum fetuin-A (HSF), humant apo-1A og hele HS for å undersøke tilstedeværelsen av serumproteiner i HS-NPer og nyregranuler. Spesifisiteten til de polyklonale antistoffene (fremstilt som beskrevet tidligere25) ble verifisert ved bruk av Western blotting (fig. 5). Hvert av de polyklonale antistoffene reagerte positivt med HS-NPs fremstilt in vitro, så vel som med mineralgranulene som finnes i humant nyrevev (fig. 6A,B, panel A1–A3 og B1–B3; svarte prikker). Antistoffene reagerte hovedsakelig med de elektrontette lagene eller den mørke kjernen av HS-NPer og nyregranuler (fig. 6A, B), noe som indikerer at disse mørke områdene kan inneholde høyere nivåer av proteiner sammenlignet med elektrongjennomskinnelige områder. Negative kontroller utført uten primært antistoff ga ingen reaksjon (fig. 6A, B, panel A4 og B4, kontroll). Vi konkluderte med at nyregranuler representerer mineraloorganiske NP-er som ligner på HS-NP-er basert ikke bare på deres morfologi og mineralsammensetning, men også på deres binding til de viktigste forkalkningshemmerne som er tilstede i serum.

Immunofluorescensmikroskopi ble brukt ved siden av for å bekrefte tilstedeværelsen av mineralgranuler som inneholder HSA og HSF i syke menneskelige nyrer. Ved å bruke denne teknikken viste menneskelig nyrevev

positiv farging for de to proteinene i forskjellige områder, inkludert interstitium som omgir nyretubuli samt cytoplasmaet til tubulusavgrensende celler (fig. 7A, panel A1 og A2). Proteinaggregater som inneholder både albumin og fetuin-A ble også lagt merke til i disse områdene, om enn i lavere mengder sammenlignet med fargingen av enkeltproteinene (fig. 7A og panel A3, sammenslått farging i gult). Spesielt la vi merke til at proteinfargingen detektert ved immunfluorescens overlappet tett med mønsteret av ektopisk forkalkning observert ved bruk av von Kossa-farging (fig. 7A, B, forkalkning er synlig som svart materiale indikert med piler i B). Disse resultatene gir ytterligere støtte for tilstedeværelsen av mineralo-organiske partikler i det undersøkte menneskelige nyrevevet.

Diskusjon

Mens det er gjort fremskritt i vår forståelse av interaksjonene mellom syntetiske NP-er og menneskelige celler, vet vi betydelig mindre om effekten av mineralo-organiske NP-er som dannes spontant i kroppsvæsker. Våre tidligere studier har vist at disse partiklene dannes i biologiske væsker når konsentrasjonene av kalsium og fosfat overstiger metning15,16. Vi observerte også at disse partiklene blir internalisert av immunceller, men at bare store partikler induserer pro-inflammatoriske immunreaksjoner23. Imidlertid har fordelingen av disse partiklene i menneskelig vev og om de spiller noen fysiologiske eller patologiske roller i kroppen ikke blitt undersøkt så langt.

I denne studien oppdaget vi for første gang mineralo-organiske NP-er i nyrene til menneskelige pasienter som lider av enten sluttstadiet av nyresykdom eller nyrekreft. De mineralo-organiske NP-ene som er påvist inneholder dårlig krystallisert kalsiumfosfat som ligner på benmineral, samt albumin, fetuin-A og apo-A1 som fungerer som systemiske forkalkningshemmere i kroppsvæsker. Resultatene våre er i samsvar med tidligere rapporter som beskrev tilstedeværelsen av mineral-proteinkomplekser i vaskulært vev og kroppsvæsker12,13,34,40. Siden partiklene vi observerte ble funnet i områder som ikke inneholder mikroskopiske forkalkninger, tyder våre observasjoner på at partiklene kan representere forløpere til ektopisk forkalkning i menneskelig vev. Gitt muligheten for at mineralo-organiske NP-er gradvis kan vokse i størrelse og gjennomgå en partikkel-til-film-konvertering under gunstige forhold som beskrevet i våre tidligere studier15,18, antyder observasjonene som presenteres her at mineralforløperne kan føre til dannelse av større mineralforekomster in vivo, som Randalls plakk og nyrestein.

Våre observasjoner om at mineralske ektopiske forkalkninger og mineraloorganiske NP-er finnes i ulike anatomiske strukturer i nyrene stemmer overens med tidligere funn av ektopiske forkalkninger i dette organet41. Evan et al.s observasjoner indikerte at mineralisering i nyrene til pasienter med nefrolithiasis kan starte og forekomme hovedsakelig i det interstitielle vevet i løkkene til Henle40,42. Disse forfatterne observerte at mineralforekomster som dannes i dette området kan stikke ut fra den basale siden av urotelet og føre til dannelse av nyrestein. Våre observasjoner antyder at, i tillegg til løkkene til Henle, kan andre nyreområder inneholde mineralske NP-er som til slutt kan utvikle seg til å danne store mineralforekomster i menneskelige nyrer. Vi undersøker også muligheten for at mineralske NP som dannes i blodsirkulasjonen kan translokere til nyrevev og indusere ektopisk forkalkning og steindannelse i nyrene.

Flere nyregranuler påvist i denne studien er funnet i intracellulære eller ekstracellulære vesikler (fig. 4H, I) og disse ligner på matriksvesiklene som er vist å indusere forkalkning i bein og tenner7,8. Vi har nylig observert at vesikler isolert fra serum fra mennesker og dyr induserer dannelsen av mineralske NP-er og mikroskopiske utfellinger in vitro25. Schlieper et al.34 observerte også at mineralpartikler funnet i arterier er assosiert med membranstrukturer og foreslo at matrisevesikler eller apoptotiske legemer kan representere kjernedannende mineralpartikler i disse vevene. Tilsvarende har Khan et al. rapporterte at kalsiumfosfatavleiringer funnet i nyrene til menneskelige pasienter med idiopatiske nyrestein er assosiert med kollagenfibre og matriksvesikler9. Disse resultatene antyder at de mineraloorganiske NP-ene som oppdages i nyrevev kan dannes via en mekanisme som involverer membranvesikler, en situasjon som er analog med det som sees i aterosklerotiske arterier7,8. På den annen side viste en nylig studie at ektopisk forkalkning funnet i kvinners brystarterier ikke var assosiert med osteogene eller apoptotiske cellemarkører43, noe som tyder på at mekanismen for forkalkning kan være spesifikk for organet eller den biologiske konteksten som er involvert. I tillegg kan mineralo-organiske NP-er, slik som de som er beskrevet her, humant nyrevev også dannes på grunn av manglende opprettholdelse av fysiologiske konsentrasjoner av ioner (f.eks. kalsium og fosfat) og forkalkningshemmere (f.eks. albumin, fetuin-A og apo). -A1) i menneskets kroppsvæsker.

Resultatene våre tyder på at det elektrontette laget og kjernen av mineral-organiske NP-er kan inneholde høyere nivåer av proteiner og organiske molekyler sammenlignet med de elektron-gjennomskinnelige områdene av partiklene (fig. 6A, B). Disse elektrontette lagene ser ut til å være mineraliserte sett av den krystallinske naturen til dette materialet under TEM (se fig. 4A–J). Andre forfattere, inkludert Ryall41 og Evan et al.44, har foreslått at det elektrongjennomskinnelige laget kan representere mineraler mens elektrontette lag kan tilsvare organiske molekyler. Disse tolkningene kan i det minste delvis skyldes måten prøvene ble behandlet og undersøkt på i hver studie, samt arten av startvevet som ble brukt.

I tillegg til å spille en rolle i ektopisk forkalkning, kan mineraler-organiske partikler indusere betennelse i nyrevev. Vi har nylig vist at mens mineralo-organiske NP ikke klarer å indusere sekresjon av pro-inflammatorisk interleukin-1 av humane makrofager, er mineralaggregater større enn 1 μm i stand til å gjøre det23. Frigjøring av interleukin-1 som respons på krystallinske materialer har vist seg å være avhengig av aktivering av intracellulære molekylære komplekser kalt inflammasomene45–47. I tillegg ble mineralpartiklene påvist i nyrer med svulster, og sammenhengen mellom kreft og betennelse er nå godt anerkjent48. Muligheten for at aggregerte mineralpartikler kan aktivere et inflammasom og bidra til utvikling av betennelse og kreft i nyrer eller annet vev gjenstår å undersøke.

I tillegg til ektopisk forkalkning kan mineralgranulene som er beskrevet her delta i andre sykdomsprosesser. For eksempel har vi tidligere foreslått at mineral-NP-er kan binde seg til ulike proteiner i kroppsvæsker og tømme disse organiske molekylene fra kroppsvæsker20,26. På den annen side kan menneskekroppen forhindre dannelse og akkumulering av mineralske NP under normale omstendigheter ved å stole på tilstedeværelsen av forkalkningshemmere og retikuloendotelsystemet (dvs. makrofager). Mineral-NP-er kan derfor akkumuleres bare når systemisk eller lokal kalsiumhomeostase er forstyrret og når beskyttelsesmekanismene har sviktet i menneskekroppen.

Vi foreslår at nanomaterialtilnærmingen utviklet her kan brukes til å studere dannelsen av mineralo-organiske NP-er i dyre- og menneskevev. For eksempel kan antistoffer reist mot forkalkningsinhibitorproteiner som albumin, fetuin-A og apo-A1 brukes i kombinasjon med mineralanalyse for å oppdage og karakterisere dannelsen av mineralo-organiske NP-er i vevet til dyremodeller. Resultatene oppnådd ved bruk av denne tilnærmingen kan brukes på kliniske målinger gjort på menneskelige kroppsvæsker for å identifisere biologiske parametere som gjenspeiler tilstanden til mineralpartikkeldannelse og ektopisk forkalkning i kroppen. Vi forventer at denne kunnskapen kan føre til utvikling av nye terapeutiske strategier for å forebygge og behandle menneskelige sykdommer og tilstander assosiert med ektopisk forkalkning.

Metoder

Nyrevev.Bruken av humant vev og eksperimentene utført i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital; Metodene og forsøkene ble utført i henhold til godkjente retningslinjer. Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra pasientene. Kontroll sunt nyrevev ble hentet fra biopsier av traume- og hematompasienter uten tidligere nyresykdom (n=2); nyrevev ble også hentet fra nyrekreftpasienter (n=20) og fra pasienter med nyresykdom i sluttstadiet (n=2) hvis nyrer ble fjernet eller biopsiert under transplantasjonskirurgi (tabell 1). For nyrekreftvev ble den ikke-kreftøse delen av vevet dissekert og analysert i denne studien.

Histologisk analyse.Nyrevev ble montert på parafinblokker. Blokkene ble seksjonert og vevsskiver ble oppvarmet på en varmeplate ved 70 grader i 30 minutter for å fjerne parafin. Seksjonene ble nedsenket i en frisk løsning av xylen tre ganger i 15 minutter for fullstendig å fjerne gjenværende parafin. Seksjonene ble rehydrert med 95 prosent, 80 prosent og 70 prosent etanol i 5 minutter hver gang. Rehydrerte prøver ble vasket med dobbeltdestillert vann (ddH2O) i 5 minutter. Cellekjerner ble farget med hematoksylin i 8 minutter. Fargestoffet ble fjernet fra prøvene med varmt vann i 10 minutter. Nyreprøver ble skylt i ddH2O og ble dyppet 10 ganger i 95 prosent etanol. De etanolbehandlede prøvene ble motfarget med eosin Y i 1 min. Prøver ble dehydrert med 95 prosent og 100 prosent etanol i 10 minutter hver gang, etterfulgt av et dehydreringstrinn i xylen i 10 minutter. De endelige dehydrerte nyreprøvene ble montert på objektglass med 50 prosent glyserol og observert under et lysmikroskop utstyrt med et digitalkamera.

Avparafiniserte og rehydrerte prøver ble preparert som beskrevet for H&E-farging. Rehydrerte seksjoner ble farget med sølvnitrat (5 prosent), etterfulgt av eksponering for UV-lys i 20 minutter. Løsningen ble vasket med ddH2O i 15 minutter. Seksjonene ble farget med natriumtiosulfat (5 prosent) i 5 minutter, etterfulgt av vasking med ddH2O i 15 minutter. Seksjonene ble farget med kjernefysisk rødt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) i 5 minutter. Fargede prøver ble dehydrert suksessivt med 95 prosent og 100 prosent etanol i 10 minutter hver, før dehydrering i xylen i 10 minutter. Nyreprøver ble montert på objektglass og undersøkt som beskrevet ovenfor.

Elektronmikroskopi og EDX-analyse.Nyreprøver ble kuttet i små biter mindre enn 1 mm tykke ved bruk av et LGPS-disseksjonsmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Vevene ble fiksert med 2,5 prosent glutaraldehyd og 1 prosent paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer ved 4 grader over natten. Faste prøver ble vasket tre ganger med 0.1 M kakodylatbuffer i 8 prosent sukrose (pH 7,2) på is i 10 minutter. Vasket vev ble inkubert i fosfatbufret saltvann (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) inneholdende 1 prosent osmiumtetroksid og 1,5 prosent kaliumferrocyanid i 2 timer på is. Vevet ble vasket med ddH2O på is 10 minutter tre ganger. Vasket vev ble farget på is med 1 prosent uranylacetat i ddH2O i 1 time, før det ble vasket tre ganger med ddH2O på is. Nyrevev ble dehydrert med 30, 50, 70, 80 og 90 prosent etanol i 10 minutter hver gang, bortsett fra når etanol nådde 70 prosent, i så fall ble prøvene lagret ved 4 grader over natten. Vev ble farget med 1 prosent fosfowolframsyre i 95 prosent etanol i 15 minutter, før dehydrering med 95 prosent etanol i 5 minutter. Prøvene ble nedsenket i propylenoksid ved 40, 57, 67 og 100 prosent i etanol i 10 minutter hver gang, etterfulgt av en ny nedsenking i 100 prosent propylenoksid i 5 minutter. Nyrevev ble infiltrert med 50, 70 og 100 prosent Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) i 1 time hver gang. Eponat 812-innebygde nyreprøver ble fremstilt ved å inkubere to ganger i 100 prosent Eponate. Innstøpte prøver ble inkubert i en ovn ved 60 grader over natten for å tillate harpikspolymerisasjon.

Vasket HS-NP-pellets oppnådd som ovenfor ble fiksert med glutaraldehyd (2,5 prosent) og paraformaldehyd (1 prosent) i ddH2O i 4 timer ved 4 grader. Faste pellets ble vasket med ddH2O tre ganger i 10 minutter hver gang. Pellets ble dehydrert med påfølgende inkubasjoner i 30, 50, 70, 80, 90, 95 og 100 prosent etanol, i 10 minutter hver gang, bortsett fra når etanol nådde 70 prosent, hvor pelletene ble lagret ved 4 grader over natten. Andre etanolløsninger ble bare satt i kontakt med pellets i 10 minutter. Dehydrerte pellets ble infiltrert med hvitt LR-innleiringsmedium (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) ved bruk av forskjellige forhold mellom etanol og LR-medium (3:1, 1:1 og 1:3) i 30 minutter hver. Pelletene ble infiltrert med friskt LR-medium (100 prosent) over natten før polymerisering. Pellets infiltrert med LR-medium ble inkubert i en ovn ved 60 grader i 2 dager for å tillate harpikspolymerisering. Nyreblokker og HS-NP-er ble seksjonert for å produsere skiver med en tykkelse på 70–100 nm ved bruk av en Reichert Ultracut S mikrotom (Leica, Wetzlar, Tyskland). Vevsseksjoner ble farget med 4 prosent uranylacetat før visualisering under et JEM 1230 transmisjonselektronmikroskop (JEOL, Tokyo, Japan) operert ved 100 kV. Elektrondiffraksjonsmønstre ble oppnådd ved bruk av det samme systemet. Nikkelgitter ble brukt som støtte.

For EDX-analyse ble tynne seksjoner av nyrevev farget med uranylacetat og vasket med ddH2O som ovenfor, etterfulgt av tørking i et elektronisk ekssikkatorskap. Prøver ble observert under et høyoppløselig JEM 2100 transmisjonselektronmikroskop (JEOL) operert ved 120 kV. EDX-spektra ble oppnådd i tre eksemplarer ved bruk av et INCA Energy EDS-system (Oxford Instruments, Abingdon, Storbritannia). Tynne deler av HS-NP ble observert uten farging.

Fremstilling av mineralo-organiske NP.Alle startløsninger ble justert til pH 7,4 og sterilisert ved filtrering gjennom 0.2μm membraner før bruk. HS ble oppnådd fra friske frivillige ved bruk av en konvensjonell venepunkturteknikk. Bruken av humane biologiske væsker i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board ved Linko Chang Gung Memorial Hospital og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra de frivillige. HS-NP-er ble fremstilt ved å tilsette 3 mM CaCl2 og Na2HPO4 hver i DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) inneholdende 10 prosent HS, etterfulgt av inkubasjon i en uke i cellekulturforhold (37 grader, 5 prosent CO2, fuktet luft). Partiklene ble pelletert ved sentrifugering ved 16, 000 xg i 15 minutter ved 4 grader og vasket to ganger med HEPES-buffer (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) ved bruk av samme sentrifugeringsprosedyre.

SDS-PAGE og Western blotting.SDS-PAGE og Western blot-analyse ble utført hovedsakelig som før15. Kort fortalt, 0,2 ug (fig. 5A,D) eller 1,2 ug (fig. 5B,C) HS-proteiner, 47 ug (fig. 5A,B,D) eller 590ug av HS-NP-proteiner (fig. 5C), 0.1 ug HSA (fig. 5A–D), og 0.6 ug (fig. 5A, C, D) eller {{23} },15 ug HSF (fig. 5B) ble oppløst i 5x "lastebuffer" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 prosent SDS, 0,05 prosent bromfenolblått, 50 prosent glyserol, 12,5 prosent - merkaptoetanol) til en sluttkonsentrasjon på 1 x , før oppvarming ved 95 grader i 5 minutter og separering under denaturerende og reduserende betingelser på en 10 prosent SDS-PAGE ved bruk av et minigelsystem (Hoefer, Holliston, MA). NP-kontrollen (brukt i felt 1 i fig. 5A–D) besto av mineral-NP-er fremstilt ved å tilsette 3 mM CaCl2 og Na2HPO4 hver i DMEM (sluttvolum på 1 ml), etterfulgt av inkubasjon i én dag i cellekulturforhold; partiklene ble pelletert ved sentrifugering ved 16, 000 xg i 15 minutter, vasket to ganger med HEPES-buffer og resuspendert i 50 ul HEPES-buffer. En alikvot på 20 ul resuspenderte partikler ble behandlet for SDS-PAGE som ovenfor. PVDF-membraner ble blokkert i 1 time i 5 prosent (w/v) avfettet melk ved romtemperatur. De primære antistoffene generert internt som beskrevet før25 ble brukt i en fortynning på 1:1,000 (-apo-A1 og -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , eller 1:6,000 ( -HSA). Det geit-anti-kanin-pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffet ble brukt basert på instruksjonene gitt av produsenten (Millipore, Billerica, MA). Blottene ble avslørt ved bruk av forbedret kjemiluminescens (Amersham Biosciences, Amersham, Storbritannia) og autoradiografiske filmer.

Immunogold-merking.Prøver ble forberedt for TEM-observasjon. HS-NP-blokker ble seksjonert i skiver mindre enn 7 0 nm tykke. Prøveseksjoner på gitter ble blokkert med 1 prosent fiskegelatin (Sigma) i 0,1 M HEPES-buffer (pH 8,0) i 25 minutter. Gitterne ble inkubert med følgende primære antistoffer: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-Al, 1:30; -HS-NP, 1:60. Den negative kontrollen inneholdt ikke noe primært antistoff (1 prosent fiskegelatin i HEPES-buffer). De inkuberte seksjonene ble skylt med HEPES-buffer i 15 minutter. Skyllede seksjoner ble blokkert med 1 prosent fiskegelatin i HEPES-buffer i 20 minutter. Prøvene ble behandlet med sekundær 5-nm-gull-konjugert geit-anti-kanin-IgG i 1 time. Prøvene ble vasket med HEPES-buffer i 10 minutter, før de ble vasket med ddH2O i 10 minutter. TEM-observasjoner ble utført som ovenfor.

Fluorescensmikroskopi.Histologiske nyrevevsglass fremstilt som ovenfor ble blokkert med 1 prosent bovint serumalbumin i 1 time ved romtemperatur. Objektglassene ble inkubert med primære polyklonale antistoffer i en fortynning på 1:4,000. Etter vasketrinn ble prøvene inkubert med de sekundære antistoffene geit-anti-kanin-FITC (492/520 nm) og geit-anti-kanin-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) ved 1:100 for 1t. Kompleksene ble vasket med PBST i 15 minutter. Den fluorescerende fargen 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble brukt ved 10 ug/ml i 15 minutter. DAPI-fargede prøver ble dehydrert med 95 og 100 prosent etanol i 10 minutter hver, etterfulgt av dehydrering i xylen i ytterligere 10 minutter. Dehydrerte nyreprøver ble montert med Vectashield fluorescence H-1000 monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og ble observert under et konfokalt mikroskop (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Tyskland) utstyrt med et Spot Flex-kamera.

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å få prøven

Referanser

1. Giachelli, CM Ektopisk forkalkning: samle harde fakta om bløtvevsmineralisering. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaskulær forkalkning: mekanismer og kliniske konsekvenser. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Calcification in aterosclerosis. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Mønstre og risikofaktorer for systemisk forkalket aterosklerose. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Mangler på kalsiumregulerende proteiner hos dialysepasienter: et nytt konsept for kardiovaskulær forkalkning i uremi. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Målretting av vaskulær forkalkning: mykgjøring av et hardt mål. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Kalsiumregulering av vaskulære glatte muskelceller-avledede matriksvesikler. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Forkalkning ved åreforkalkning: beinbiologi og kronisk betennelse ved arteriell korsvei. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Association of Randalls plakk med kollagenfibre og membranvesikler. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biokjemisk karakterisering av serumfetuin-mineralkomplekset. J Biol Chem. 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Serumnivåer av fetuin-mineralkomplekset korrelerer med arterieforkalkning hos rotte. J Biol Chem. 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Hierarkisk rolle av fetuin-A og sure serumproteiner i dannelsen og stabiliseringen av kalsiumfosfatpartikler. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Nanoanalytisk elektronmikroskopi avslører grunnleggende innsikt i menneskelig kardiovaskulær vevsforkalkning. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Påståtte nanobakterier i menneskeblod som kalsiumkarbonat-nanopartikler. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Putative nanobakterier representerer fysiologiske rester og kulturbiprodukter av normal kalsiumhomeostase. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Karakterisering av granuleringer av kalsium og apatitt i serum som pleomorfe mineraloproteinkomplekser og som forløpere for antatte nanobakterier. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineralkomplekser som ligner serumkalsiumgranuler og antatte nanobakterier: demonstrasjon av et dual inhibering-seeding-konsept. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Fremveksten og fallet av nanobakterier. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritisk evaluering av gammabestrålt serum brukt som mater i kulturen og demonstrasjon av antatte nanobakterier og forkalkende nanopartikler. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Omfattende proteomisk analyse av mineralnanopartikler avledet fra menneskelige kroppsvæsker og analysert ved væskekromatografi-tandem massespektrometri. Anal Biochem 418, 111–125 (2011).