Evaluering av slimhinneimmunitetseffekten av bovint viral diarévirus underenhetsvaksine E2Fc og E2Ft

Abstrakt:

Klassifisert som en infeksjonssykdom av klasse B av World Organization for Animal Health (OIE), er bovin viral diaré/slimhinnesykdom en akutt, svært smittsom sykdom forårsaket av bovint viral diarévirus (BVDV). Sporadiske endemier av BVDV fører ofte til store økonomiske tap for meieri- og storfekjøttindustrien. For å belyse forebygging og kontroll av BVDV utviklet vi to nye underenhetsvaksiner ved å uttrykke bovint viralt diarévirus E2-fusjonsrekombinante proteiner (E2Fc og E2Ft) gjennom suspenderte HEK293-celler. Vi evaluerte også immuneffektene av vaksinene. Resultatene viste at begge underenhetsvaksinene induserte en intens slimhinneimmunrespons hos kalver. Mekanistisk bindet E2Fc seg til Fc-reseptoren (Fc RI) på antigenpresenterende celler (APCs) og fremmet IgA-sekresjon, noe som førte til en sterkere T-celle-immunrespons (Th1-type). Den nøytraliserende antistofftiteren stimulert av den slimhinneimmuniserte E2Fc-underenhetsvaksinen nådde 1:64, som var høyere enn for E2Ft-underenhetsvaksinen og den for den intramuskulære inaktiverte vaksinen. De to nye underenhetsvaksinene for slimhinneimmunitet utviklet i denne studien, E2Fc og E2Ft, kan videre brukes som nye strategier for å kontrollere BVDV ved å forbedre cellulær og humoral immunitet.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Stikkord: BVDV; underenhetsvaksine; slimhinnevaksinasjon; molekylære hjelpestoffer; Fc-reseptor; ferritin

1. Introduksjon

Det bovine virale diaréviruset (BVDV), sammen med grensesykdomsviruset (BDV) og svinepestviruset (CSFV), tilhører Pestivirus-slekten i Flaviviridae-familien [1]. En kombinasjon av vedvarende infeksjon (PI) og cytopatisk infeksjon hos kalver resulterer ofte i alvorlig slimhinnesykdom, med dødelighet på opptil 100 % [2]. BVDV distribuerer bredt i verden, med en relativt høy antistoff-positiv rate. I Kina er utbredte typer 1B, 1M og 1Q av typen -1 BVDV [3–5]. Fylogenetisk analyse viste at bovint viralt diarévirus type 1 ble importert til Kina på 1960-tallet og at minst åtte BVDV-1-genotyper er i omløp i Kina. Blant dem er 1B og 1m de viktigste genotypene [6]. Dette samsvarer med vår epidemiologiske undersøkelse av BVDV i Tibet. Det sfæriske virionet til BVDV er omtrent 40–60 nm i diameter og er omsluttet av en kapsel. Det enkelt plusstrådede virale RNA-genomet til BVDV er omtrent 12,5 KB langt. Det virale polyproteinet spaltes deretter av en kombinasjon av verts- og virale proteaser til fire strukturelle (C, E0, E1, E2) og åtte ikke-strukturelle (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) proteiner [7, 8]. BVDV-E2 har sterk immunogenisitet, og bevis har vist at nøytraliserende antistoffer (NAbs) indusert i infiserte dyr hovedsakelig retter seg mot E2 [9]. I mellomtiden kan multivalente E2-underenhetsvaksiner rettet mot store sirkulerende stammer av BVDV gi delvis beskyttelse mot homologe stammer. En rekombinant herpesvirusvaksine konstruert med BVDV E2-protein og bovint herpesvirus 1 (BoHV-1) D-protein induserte spesifikke immunresponser mot begge virusene i verten etter intranasal forstøver [10]. Derfor kan det være en god strategi å kontrollere BVDV ved å bruke det immundominante BVDV E2-proteinet som en underenhetsvaksine. Nesehulen er rik på lymfocytter og antigenpresenterende celler, gir et egnet mikromiljø for slimhinneimmunisering og beskytter proteinvaksiner fra å bli destabilisert av syrer og alkalier. I tillegg er intranasal vaksineindusert immunglobulin A (IgA) og resident memory B og T-lymfocytter i de øvre luftveiene i stand til effektivt å blokkere viral replikasjon [11]. Immunisering gjennom nesehulen induserer ikke bare slimhinneimmunitet, men stimulerer også systematiske immunresponser, som utøver immunbeskyttende effekter. Tidligere studier har funnet at antigener kan leveres fullstendig inn i slimhinneepitelet ved å målrette underenhetsvaksiner til den neonatale Fc-reseptoren (FcRn) av M-celler på slimhinneepitelet, og derved effektivt stimulere spesifikke immunresponser [12–14]. Immuniseringseffektene av nesespray forsterkes betydelig ved å bruke en løselig rekombinant vaksine dannet ved fusjon av molekylært adjuvans og immunantigen [15]. IgGFc interagerer med FcRn på overflaten av immunceller for å delta i transporten av IgG gjennom slimhinneoverflater, og forbedrer immunogenisiteten til Fc-sammensmeltede proteiner hos pattedyr [16]. IgGFc-fusjonsproteiner ble rapportert å danne stabile dimerer gjennom disulfidbindinger i Fc-hengselregionen for å øke halveringstiden og stabiliteten til rekombinante proteiner, og dermed forbedre de cellulære, slimhinne- og humorale immunresponsene [17,18]. Nye vaksiner mediert av IgGFc har blitt brukt på influensa A-virus (HA-HuFc) [19] og svinepestvirus (CSFV-E2Fc) [20].

Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Den passende overflatemodifikasjonen gjør at nanopartikler kan ligge stabilt i blodsirkulasjonssystemet [21]. Karakterisert av et stort overflateareal og en hul sfærisk struktur, ble Ferritin (Ft) rapportert å danne nanopartikler av 24 identiske polypeptider ved selvmontering med en rekke uttrykte fusjonsproteiner, som fremmet antigengjenkjenning og opptak av antigenpresenterende celler, og dermed induserer en sterk immunrespons [22,23]. Ferritin er mye brukt i vaksineutvikling. Kovalent integrasjon av det reseptorbindende domene (RBD)-antigenet til SARS-CoV-2 spike-proteinet og selvmontert Helicobacter pylori non-heme ferritin resulterer i en kraftig produksjon av nøytraliserende antistoffer. Ferritinproteinnanopartikler har også en sterk evne til å forbedre antigenstabiliteten, overvinne biologiske barrierer og oppnå målrettet levering. Ettersom nanovaksiner effektivt kan fanges opp av dendrittiske celler og makrofager [24], er ferritin-nanopartikler en ny og lovende plattform for antigenlevering. For tiden er de viktigste tilgjengelige vaksinene for BVDV inaktiverte vaksiner og underenhetsvaksiner, som begge krever tidkrevende og arbeidskrevende vaksinasjon ved intramuskulær injeksjon. I mellomtiden er inaktiverte vaksiner produsert gjennom MDBK-celler utsatt for å indusere bovin neonatal pancytopeni (BNP) [25]. Imidlertid har underenhetsvaksiner vist overlegne sikkerhetsprofiler [26]. Intranasal immunisering har vist seg å målrette antigener mot Fc R-reseptoren, og forårsake slimhinner og systemiske immunresponser [15,16]. Imidlertid er immuneffektene av intranasal immunisering med BVDV-vaksiner og effektiviteten av BVDV-E2 kombinert med molekylære hjelpestoffer (IgGFc og Ft) fortsatt dårlig studert. Derfor er utviklingen av slimhinnevaksiner med BVDV-E2-protein for å forbedre deres immuneffekt en topp prioritet på dette feltet. I den nåværende studien ble E2-proteinsammensmeltede Fc- eller Ft-underenhetsvaksiner generert i HEK293-celler. Funnene viste at nasal vaksinasjon med BVDV E2Fc-underenhetsvaksinen var mer effektiv enn nesevaksinasjon med E2Ft-underenhetsvaksinen, noe som ytterligere støtter indikasjonene på at E2Fc-fusjonsproteinet er et mer potent underenhetsvaksinealternativ.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

2. Resultater

2.1. Ekspresjonen av rekombinante proteiner i suspenderte HEK293-celler

Strukturelle diagrammer av E2, E2Ft og E2Fc er vist i figur 1A. Indirekte immunfluorescensanalyser ble først utført ved bruk av konservert monoklonalt antistoff (mAb) BVDVE2 for å verifisere immuno-ekspresjonen av rekombinante fusjonsproteiner. Celler transfektert med plasmider som inneholder E2-, E2Ft- eller E2Fc-gener sendte ut et fluorescerende signal, mens mock-behandlede celler ikke viste et fluorescerende signal (figur 1B). Dette indikerte sterkt uttrykk av E2, E2Ft og E2Fc i HEK293-celler. For å bestemme om disse proteinene var sekretorisk uttrykt, ble supernatantene av HEK293-celler transfektert med plasmider inneholdende E2-, E2Ft- eller E2Fc-gener samlet etter 6 dager. Immunoekspresjonsnivåene til hvert protein ble analysert ved Western blot med BVDV-E2-antistoff. Resultatene viste at celler transfektert med plasmider som inneholder gener av E2, E2Ft og E2Fc uttrykte tilsvarende proteiner med molekylmasser på henholdsvis 45 kDa, 60 kDa og 80 kDa (figur 1C). SDS-PAGE og Coomassie blå fargeresultater viste at båndene til hver prøve var i samsvar med blotting-resultatene (figur 1D). For å sikre spesifisiteten og nøyaktigheten for påvisning av proteinimmunoekspresjonen, ble pre-absorpsjonsanalyser av BVDV-E2 mAb først utført og fulgt av virale replikasjonsanalyser og Western blot for å vitne om spesifisiteten til BVDV E2 mAb. Resultatene viste at antistoffet bare kan reagere på BVDV-E2-proteinet (figur S1). Samlet viste bevisene at rekombinante proteiner E2, E2Fc og E2Ft ble uttrykt rikelig i HEK293-celler.

Figur 1. Immunuttrykk og identifikasjon av E2-, E2Ft- og E2Fc-proteiner i HEK293-celler. (A) Konstruksjonsdiagrammene til BVDV-E2, BVDV-E2Ft og BVDV-E2Fc. (B) Deteksjon av immuno-ekspresjonen av rekombinante proteiner ved IFA; 48 timer etter transfektert med E2, E2Fc eller E2Ft, ble HEK293-celler fiksert for IFA. BVDV E2 monoklonalt antistoff og FITC-geit anti-mus IgG ble påført som henholdsvis primært og sekundært antistoff. Kjernen ble farget med DAPI (blå). Skalaen representerer 20 µm. (C) Deteksjon av rensede rekombinante proteiner ved Western blot. (D) Identifikasjon av rensede rekombinante proteiner ved SDS-PAGE.

2.2. Aktivering av APC-Fc RI av BVDV-E2Fc

Antigengjenkjenning av BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) av makrofager spiller en viktig rolle i aktiveringen av immunresponsen. For å påvise aktiveringseffekten av fusjonsproteinet på immunsystemet, ble gjenkjennelsesfunksjonen og fagocytisk aktivitet til fusjonsproteinet av bovine alveolære makrofager (BAM) verifisert in vitro. Resultatene viste at CD64 (Fc RI), påvist av Cy3-merkede geit-anti-kanin-IgG-antistoff-markører (røde), var lokalisert i cytoplasma og cellemembran i storfemakrofager. E2Fc ble påvist ved bruk av geit-anti-mus IgG (grønn fluorescens). Bilder ble slått sammen for analyse av samlokalisering av CD64 (Fc RI) og E2Fc i bovine alveolære makrofager (gul farge; figur 2A). I motsetning til dette samlokaliserte ikke CD64 seg med E2 eller E2Ft. Resultatene viste at translokasjon av E2Fc-fusjonsproteinet over slimhinnebarrieren ble mediert av Fc RI.

Figur 2. Aktivering av APC-Fc RI ved BVDV-E2Fc. (A) Samlokaliseringsanalyse av CD64 (Fc RI) med E2Fc-protein på BAM ble påvist ved konfokalmikroskopi. CD64 (Fc RI) på BAM ble farget med kanin-anti-CD64 og Cy3-merket geit-anti-kanin IgG som henholdsvis primære og sekundære antistoffer.

Fagocytose, opptak av partikler av makrofager, ble målt som fagocytosehastigheten. Fagocytoseratene for FITC-konjugerte mikrosfærer, E2-protein, E2Ft og E2Fc av de bovine alveolære makrofagene var henholdsvis 28,9 %, 55,6 %, 57,1 % og 65,6 %. Med andre ord, fagocytosehastigheten til E2Fc var høyere enn for E2Ft, noe som ytterligere beviste at fangsten av antigener av monocytter ble fullført ved binding av en spesifikk reseptor på overflaten med tilsvarende ligander. Imidlertid hadde bovine alveolære makrofager ingen reseptorer for E2- og E2Ft-proteiner, og de fjernet bare fremmedlegemer gjennom fagocytose, som er den mest grunnleggende forsvarsmetoden til kroppen (figur 2B).

2.3. Potente slimhinner og humorale immunresponser indusert av E2Fc in vivo

Kalveimmuniseringsprosedyren er avbildet i figur 3A. Nivåene av IgA og SIgA produsert av kalver immunisert med fusjonsproteinet ble påvist ved indirekte ELISA. Serum-, avførings- og neseslimhinneprøver ble samlet og påvist av et kommersielt ELISA-sett. Den E2Fc-immuniserte gruppen viste de høyeste nivåene av IgA og SIgA i serum og slimhinner, både hos intramuskulært og slimhinneimmuniserte dyr (p < 0.01) (Figur 3B, C). Ingen signifikante forskjeller i IgA-nivåer ble observert mellom den E2- E2-immuniserte gruppen og den E2Ft-immuniserte gruppen, men de var forskjellige i SIgA-nivåene (p < 0,05). Som konklusjon var E2Fc-fusjonsproteinet i stand til å indusere mer potente slimhinne- og humorale immunresponser enn andre proteiner.

2.4. E2Fc kan indusere sterkere T-celle immunresponser (Th1 Type) mot BVDV sammenlignet med E2Ft In Vivo

Th{{0}}cytokinet IFN- uttrykt av T-celler og NK-celler medierer cellulær immunitet, som er avgjørende for virusclearance. For å påvise fordelingen av IFN-uttrykkende CD4+ og CD8+ T-celler i kalver, ble lymfocytter isolert fra PBMC til kalver 35 dager etter immunisering. Lymfocytter ble stimulert med inaktivert BVDV, og flowcytometri ble deretter brukt for å identifisere IFN- -utskillende CD4+ og CD8+ T-celler. Slimhinneimmuniserte grupper med E2Fc og E2Ft viste signifikant høyere andeler av IFN- -utskillende CD4+ og CD8+ T-celler sammenlignet med E2-gruppen. Gruppen som var slimhinneimmunisert med E2Fc hadde et høyere nivå av IFN- -utskillende CD3+-avledede CD8+ T-celler enn gruppen immunisert med inaktivert BVDV (p < 0,05) (figur 4). Det ble imidlertid ikke observert noen signifikant forskjell i IFN- -utskillende CD3+-avledede CD4+ T-celler mellom gruppene med slimhinneimmunisert E2Fc og med inaktivert BVDV. Oppsummert induserer både intramuskulær injeksjon og slimhinneimmunisering med E2Fc sterkere T-celle immunresponser (Th1 type) mot BVDV sammenlignet med E2Ft.

Figur 3. Flytskjema for kalveimmuniseringseksperimenter og slimhinne- og humorale immunresponser indusert av E2Fc in vivo. (A) BVDV-underenhetsvaksinekonstruksjon og flytskjema for kalveimmuniseringseksperiment. (B, C) Målingen av (B) IgA- og (C)-sekretoriske IgA-nivåer i neseprøver, avføring og serumprøver samlet på dag 14 etter sekundær immunisering med ELISA. n=5, * p < 0.05, og ** p < 0,01

Figur 4. T-celle immunresponser mot BVDV in vivo. Prosentandel av (A) CD4+ IFN- + T-celler og (B) CD8+ IFN- + T-celler etter stimulering i bovine perifere mononukleære blodceller. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 og ** ** p < 0,0001.

2.5. Vaksinering med rekombinante underenhetsvaksiner øker innholdet av 1-cytokiner av typen Th1-

For å bekrefte effekten av rekombinant underenhetsvaksine på cellulære immunresponser, analyserte vi lymfocytt- og cytokinproliferasjonsnivåer i det perifere blodet til immuniserte kalver. Først ble antikoagulanter samlet fra kalver 49 dager etter immuniseringen. Lymfocytter ble stimulert av den ultrafiolett-inaktiverte BVDV etter separasjon, og korrelerte indekser ble målt. Sammenlignet med PBS-gruppen ble lymfocyttstimuleringsindeksene (SI) for grupper immunisert med underenhetsvaksinene (E2, E2Fc og E2Ft) alle økt i forskjellig grad, med den høyeste lymfocyttstimuleringsindeksen (p < 0). 001) i de E2Fc-immuniserte og de inaktiverte vaksinegruppene (figur 5A). I tillegg ble kommersielle doble antistoff sandwich ELISA-sett mot bovin IFN-, IL-2 og IL-4 brukt for å påvise cytokinnivåer av Th1- og Th2-type i perifert blod fra immuniserte kalver. Sammenlignet med PBS-behandlede kalver, var nivåene av IFN- og IL-2 uttrykt i immuniserte kalver signifikant høyere enn IL-4 49 dager etter immunisering. Nivåene av IFN- var høyere i IN-E2Fc-gruppen enn i den inaktiverte vaksinegruppen (p < 0,05), men det var ingen forskjell i IL-2 og IL-4 mellom IM-E2Fc og de inaktiverte vaksinegruppene (figur 5B–D). Disse resultatene antydet at IN-E2Fc-underenhetsvaksinen betydelig fremmet Th1--typen cellulær immunrespons hos kalver.

Figur 5. Innholdsøkningen av cytokiner av Th1-type etter immunisering med rekombinante underenhetsvaksiner. (A) Celleproliferasjonen av perifere blodlymfocytter fra kalver etter immunisering 49 dager ble detektert av lymfocyttproliferasjonsanalysesett. (B–D) Th1- og Th2-cytokiner i lymfocyttsupernatanter ble påvist av bovint IFN-, IL-2, IL-4 dobbeltantistoff-sandwich ELISA-sett. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01, og *** p < 0.00

2.6. BVDV-spesifikke antistoffer kan induseres sterkt av rekombinante E2Ft- og E2Fc-underenhetsvaksiner in vivo

BVDV-spesifikke antistoffer ble påvist ved ELISA for å utforske den humorale immunresponsen indusert av E2-, E2Ft- og E2Fc-underenhetsvaksinene. BVDV-spesifikke antistoffer kunne ikke påvises i alle kalver før immunisering. Nivåene av antistoffer indusert av E2Ft- og E2Fc-underenhetsvaksiner var signifikant høyere enn nivåene for E2-gruppen 21 dager etter initiering (første dose) av immunisering (p < 0.00 1). Antistoffnivåer for slimhinneimmunitet etter 35 dager (14 dager etter andre dose) og 49 dager (14 dager etter tredje dose) var signifikant forskjellig mellom E2Ft- og E2-gruppene (p < 0,05). I tillegg var E2Fc signifikant høyere enn E2 (p < 0,001). Antistoffnivået i slimhinneimmuniseringsgruppen (IN-E2Ft- og IN-E2Fc-gruppene) var høyere enn for den intramuskulære injeksjonsgruppen (IM-E2Ft- og IM-E2Fc-gruppene), og antistoffnivået til den inaktiverte vaksinegruppen var ikke signifikant forskjellig fra IN-E2Fc-gruppen (Figur 6). Til sammen var rekombinante E2Ft- og E2Fc-underenhetsvaksiner i stand til å indusere sterke humorale immunresponser, og slimhinneimmunitet var overlegen den for den intramuskulære injeksjonen, noe som indikerer at rekombinante E2Fc- og E2Ft-underenhetsvaksiner var svært antigene.

Figur 6. Påvisning av antistoffer i serumprøvene til immuniserte kalver ved ELISA på dag 0, 21, 35 og 49 etter immunisering. n=5, * p < 0.05 og *** p < 0,001

2.7. Nøytraliserende antistoffer mot BVDV indusert av rekombinante underenhetsvaksiner in vivo

Blodprøver ble tatt fra halsvenen til kalver ved 0, 21, 35 og 49 dager etter den første immuniseringen. Serumprøver ble separert aseptisk og inaktivert i et vannbad ved 56 ◦C i 30 minutter. Nøytraliseringsanalyser ble utført for å bestemme antistoffnivåene i det separerte serumet. De nøytraliserende antistoffene mot BVDV ble påvist i slimhinneimmuniserte grupper med rekombinante underenhetsvaksiner, med titeren til det E2Fc-nøytraliserende antistoffet opp til 1:64. Dette er sammenlignbart med den inaktiverte vaksinen og bedre enn de intramuskulært injiserte E2Ft og E2Fc rekombinante underenhetsvaksinene (Figur 7).

Figur 7. Påvisning av nøytraliserende antistoffer i serumprøvene til immuniserte kalver på dag 0, 21, 35 og 49 etter immunisering. Inaktiverte serumprøver ble ratiofortynnet og pre-inkubert med 200 TCID50 BVDV XZ02 i 1 time. Serumprøver ble deretter tilsatt til celler i 96-brønnplater og inkubert i 72 timer. Kanin-anti-E2-antistoff og FITC-konjugert geit-anti-kanin-IgG ble brukt som primære og sekundære antistoffer. n=5, * p < 0,05 og ** p < 0,01

3. Diskusjon

Det har blitt rapportert at E2-proteinet uttrykt i pattedyrceller er mer effektivt til å nøytralisere beskyttelse mot BVDV enn E2-proteinet oppnådd fra baculovirus-insektekspresjonssystemet (brE2) [27]. Suspensjonskulturen av pattedyrceller er preget av en enklere prosess og høyere utbytte [28]. Suspenderte HEK293-celler er i stand til å vokse under serumfrie forhold, og celleantallet er flere ganger større enn det til den adherente kulturen, som kan brukes til storskala produksjon av antistoffer [29]. Ekspresjonseffektiviteten til pcDNA3.1 kombinert med det transiente ekspresjonssystemet for eukaryote suspensjonsceller som ble brukt i denne studien var relativt høy, og det rekombinante proteinet kunne samles seks dager etter transfeksjon, med en konsentrasjon på opptil 30 mg·L -1, som var tilstrekkelig for påfølgende dyrepåføring.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Det bovine virale diaréviruset invaderer hovedsakelig de øvre luftveiene og fordøyelseskanalen, noe som forårsaker rhinoré, hoste, kortpustethet, økning i kroppstemperaturen og leukopeni, og det etterfølges av viremi når viruset kommer inn i blodet. Derfor kan inhalert intranasal vaksinasjon gi mer effektiv beskyttelse enn vaksiner som leveres direkte til virusinfeksjonssteder. Nylig ble det vist at intranasal immunisering kan presentere antigener til Fc R-reseptorer og fremkalle slimhinner og systematiske immunresponser [16]. Videre var bovin IgG1Fc i stand til å binde seg til bovin Fc R, en høyaffinitetsreseptor for IgG [30]. Resultatene våre ga bevis på at Fc fra bovin IgG1 kunne binde seg til Fc RI på bovine alveolære makrofager (BAM) for å oppnå transmukosal transport. Dette kan forlenge levetiden til fusjonsproteinet i kroppen og fremme produksjonen av spesifikke antistoffer. Resultatene våre viste at nivået av SIgA indusert av slimhinneimmunisert E2Fc var signifikant høyere enn det for slimhinneimmunisert E2 (p < 0.{{30}}1). Imidlertid ble det bare observert en liten forskjell mellom den intramuskulære injiserte E2Fc-gruppen og den slimhinneimmuniserte E2-gruppen. Dette kan være forårsaket av det faktum at tynntarmens slimhinne og mesenteriske lymfeknuter begge vil frigjøre en liten mengde SIgA som respons på intramuskulær injeksjon med E2Fc adjuvans med 1313VG. Nivåene av IFN- fremkalt ved slimhinneimmunisering med E2Fc var signifikant høyere enn nivåene av slimhinneimmunisering med E2 (p < 0,01), intramuskulær immunisering med E2Fc og slimhinneimmunisering med E2Ft. Nivåene av IL-2 fremkalt av slimhinneimmunisering med E2Fc var signifikant høyere enn nivåene av slimhinneimmunisering med E2, og intramuskulær immunisering med E2Ft (p < 0,01). I neste trinn ble de totale antistoffnivåene påvist etter den tredje immuniseringen. Resultatene viste at slimhinneimmunisering med E2Fc induserte signifikant høyere nivåer av totale antistoffer sammenlignet med slimhinneimmunisering med E2 (p < 0,001), mens antistoffnivåene indusert av intramuskulært injisert E2Fc og slimhinneimmunisert E2 var sammenlignbare med intramuskulært injisert E2F gruppe. De totale immuneffektene av slimhinneimmuniseringen av E2Fc-underenhetsvaksinen var overlegne i forhold til den intramuskulære immuniseringen. Slimhinneimmunisering av E2Fc induserte ikke bare sekresjonen av SIgA, men fremkalte også spesifikk Th1--type cellulær immunrespons og humoral immunrespons.

Det ble rapportert at CSFV E2-glykoproteinet vist på overflaten av ferritin-nanokager induserte potent ekspresjon av de medfødte immuncytokinene IL-4 og IFN- i kaniner [31]. En nanopartikkelvaksine utviklet ved å kovalent binde selvmontert ferritin til reseptorbindingsdomenet (RBD) til SARS-CoV-2 ble også bevist å fremkalle en robust humoral og cellulær immunrespons [24]. Nesehulen er rik på slimhinneassosiert lymfoidvev, og vi viste at SIgA-nivåene indusert av slimhinneimmunisert E2Ft var høyere enn E2 (p < 0.05). CD4+ og CD8+ T-celler var signifikant høyere i den slimhinneimmuniserte E2Ft-gruppen enn i E2-gruppen (p < 0,01). CD4+ og CD8+ T-celler spiller en viktig rolle i forsvaret mot virusinfeksjon [32]. Nøytraliseringstest og antistoffanalyseresultater viste også at slimhinneimmunisering med E2Ft var mer effektiv enn immunisering med intramuskulær E2Ft og E2. Dette var sannsynligvis fordi antigengjenkjennings- og presentasjonssystemet til organismen effektivt fagocyterte ferritin (E2Ft) med 24 subenhetspolymerer, noe som resulterte i en sensitiv og effektiv antistoffrespons in vivo. Antistoffer skilles ut av plasmaceller, og nøytraliserende antistoffnivåer er en viktig indikator for påvisning av immuneffekter. Når den nøytraliserende antistoffstyrken til BVDV-vaksinen er større enn 1:24, indikerer det at vaksinen er immunogen [33].

I denne studien ble nøytraliseringsanalyser utført for å evaluere de nøytraliserende antistoffnivåene indusert av E2 rekombinante proteiner. Derfor ble halsveneblodet fra immuniserte kalver samlet for å påvise nivået av IgG-antistoffer i serum. Resultatene viste at alle immuniserte kalver produserte forskjellige grader av nøytraliserende antistoffer 14 dager etter den andre immuniseringen. De nøytraliserende antistoffnivåene i kalver av den slimhinneimmuniserte E2Fc-gruppen og den inaktiverte vaksinegruppen økte betydelig og forble på 1:64 14 dager etter den tredje immuniseringen (nøytraliserende antistofftitere ble påvist inntil sjette uke). Det er imidlertid verdt å merke seg at de nøytraliserende antistoffnivåene av slimhinneimmuniserte E2 og E2Ft og intramuskulært immuniserte E2Fc og E2Ft grupper ble opprettholdt mellom 1:8 og 1:16. Vi konkluderer med at antigener fra den rekombinante E2Fc-vaksinen frigjøres sakte av Fc-reseptoren, og forårsaker derfor forlengede humorale og cellulære immunresponser. I motsetning til dette ligger de andre fire underenhetsvaksinene kort tid i kroppen på grunn av mangelen på en tilsvarende reseptor. Derfor kan en boostervaksinasjon eller bytte av adjuvans være nødvendig for å oppnå de forventede immuneffektene.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

4. Materialer og metoder

4.1. Virus og celler

Type 1b BVDV XZ02-stamme (GenBank-aksessnummer: MF278652) ble isolert fra Tibet og dyrket ved bruk av Madin-Darby bovine nyreceller (MDBK). Porcint epidemisk diarévirus (PEDV) ble bevart i vårt laboratorium. MDBK-celler ble kjøpt fra ATCC (ATCC- CCL-22) og opprettholdt i DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, Kina), og bovine alveolære makrofagceller (BAM) ble opprettholdt i RPMI{ {8}} (Cat NO. SH30027, Cytiva, Shanghai, Kina); alle mediene inneholdt 10 % varmeinaktivert hesteserum (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, USA) og ble inkubert ved 37 ◦C i en fuktet inkubator med 5 % CO2. Suspenderte HEK293-celler ble kjøpt fra ATCC (ATCC CRL-1573) og dyrket i et serumfritt KOP293-medium (Cat NO. M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, Kina).

4.2. Antistoffer og testsett

Følgende antistoffer og testsett ble brukt i denne studien: anti-BVDV E2 antistoff (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK); HRP-geit-anti-muse-antistoff (kat. nr. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-geit-anti-muse-antistoff (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); FITC-geit anti-mus antistoff (kat. nr. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); CD64 (Fc RI) antistoff (Kat. nr. abs135850, Absin, Shanghai, Kina); Alexa Fluor® 488 geit-anti-mus IgG-antistoff (kat. nr. ab150113, Abcam, Cambridge, Storbritannia); Cy3-geit-anti-kanin IgG-antistoff (kat. nr. ab6939, Abcam, Cambridge, Storbritannia); FITC-konjugerte mikrosfærer (kat. nr. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); FITC-CD4-antistoff (kat. nr. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); PE-CD8-antistoff (kat. nr. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN-antistoff (kat. nr. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); FITC-geit anti-kanin IgG-antistoff (kat. nr. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Sett og reagenser inkluderer BVDV-E2 antistoffdeteksjonssett (kat. nr. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, Kina); IgA-deteksjonssett (kat. nr. 177090b, CAMILO, Nanjing, Kina); SIgA-deteksjonssett (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, Kina); IFN-deteksjonssett (kat. nr. 177020b, CAMILO, Nanjing, Kina); IL-2 deteksjonssett (kat. nr. 177028b, CAMILO, Nanjing, Kina); IL-4 deteksjonssett (kat. nr. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Kina); TA-293 transfeksjonsreagens (kat. nr. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Kina); Lymfocyttseparasjonsmedium (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Plasmidkonstruksjon

Avkortet E2 (betegnet som E2 heretter) ble generert ved å fjerne den transmembrane regionen til E2 (gensekvens-aksessnummer: MF278652) ved å bruke TMHMM-nettverktøyet (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ tilgjengelig på 12. januar 2023) og legge til en histidin-tag til C-terminalen (figur 1A). Gensekvensen er vist i tilleggsmateriale S1. E2Fc-plasmid ble konstruert ved å legge til et Fc-fragment som inneholdt hengselregionen til det bovine IgG1 (aksesjonsnummer: x62916.1) til C-terminalen til E2 med den ordinære posisjonen til E2-syntetisk fleksibel peptidhengselregion -CH2-CH3-domene-6 × His [20]. Gensekvensen er vist i tilleggsmateriale S2. E2Ft-plasmidet ble konstruert ved å koble E2 til Helicobacter pylori ferritin (restene 5–167) via linkeren (Gly)3Ser [34]. Gensekvensen er vist i tilleggsmateriale S3. IL-2-signalpeptidet ble lagt til N-terminalen til E2, E2Fc og E2Ft for å lette sekretorisk ekspresjon [35]. Målgenene (E2, E2Ft og E2Fc) ble klonet inn i pcDNA3.1 med henholdsvis BamHI og XhoI.

4.4. Proteinuttrykk og rensing

Omtrent 10{{30}} mL suspenderte HEK293-celler på eksponentiell stadium (omtrent 2~4 × 106 celler/mL) ble transfektert med tilsvarende plasmider. Kort fortalt ble 5 ml KPM (transfeksjonsbuffer) og 100 µg sterilt plasmid-DNA tilsatt til et sterilt sentrifugerør, og 5 ml KPM og 500 µL TA-293 (Kat. nr. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Kina ) transfeksjonsreagenser ble tilsatt til et annet sterilt sentrifugerør. Deretter ble et fortynnet transfeksjonsreagens tilsatt til det fortynnede plasmidet og blandet grundig. Etter inkubering i 10 minutter ved romtemperatur ble et DNA-transfeksjonsreagenskompleks tilsatt til cellene, ledsaget av risting. Celler ble inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ◦C med 5 % CO2 ved en rystehastighet på 140 rpm/min. Celler ble høstet seks dager etter transfeksjon ved sentrifugering i 30 minutter ved 12, 000 rpm/min og filtrert med et 0,22 mm filter for å fjerne gjenværende celleavfall. Nikkelaffinitetskromatografikolonnene (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, USA) ble brukt for histidin (His)-merket affinitetsrensing av E2-, E2Ft- og E2Fc-proteiner [36]. Kort fortalt ble 100 ml prøver tilsatt til affinitetskolonner med en hastighet på 1 ml/min. Kolonnene ble deretter vasket med fem kolonnevolumer (CV) buffer A (0,1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) med en hastighet på 1 ml/min. Til slutt ble konsentrasjonsgradienter av imidazol (fra 0 til 500 mM) tillatt å strømme gjennom kolonnen med en hastighet på 1 ml/min for å samle opp væsken som tilsvarer hovedtoppen. Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert med et BCA-proteindeteksjonssett. Innsamlede proteiner ble videre brukt for Western blot-analyse.

cistanche planteøkende immunsystem

4.5. Western Blot

Proteiner ble separert ved bruk av SDS-PAGE. Etter å ha blitt overført til NC-filtermembranen, ble proteiner blokkert med 2 % skummetmelkpulver over natten ved 4 ◦C og deretter inkubert med anti-BVDV E2-antistoff (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Storbritannia) i 2 timer ved romtemperatur . Etter å ha blitt vasket tre ganger med TBS-T, ble membranene inkubert med HRP-geit anti-mus (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket tre ganger med TBS-T, ble ECL-kjemiluminescenssystemet brukt for å påvise proteinimmuno-ekspresjon.

4.6. Indirekte immunfluorescens

For immunfluorescensdeteksjon av immunekspresjonen av rekombinante proteiner ble HEK293-celler transfektert med plasmider som uttrykker E2, E2Ft og E2Fc; 48 timer etter transfeksjon ble cellene fiksert med paraformaldehyd i 15 minutter. Etter å ha blitt vasket tre ganger med PBS, ble cellene permeabilisert med 0.5% Trition-X100 i 15 min. Etter en intensiv vask med PBS ble cellene deretter blokkert med 2% BSA og inkubert med et 1:500 fortynnet BVDV E2 monoklonalt antistoff (fremstilt i vårt laboratorium) ved 37 ◦C i 2 timer. Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) eller FITC-konjugerte geit-anti-muse-antistoffer (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) ble påført som sekundært antistoff. Kjernene ble farget med DAPI i 10 minutter ved romtemperatur. Proteiner ble visualisert ved konfokal mikroskopi (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Tyskland) [37].

4.7. APC-målretting av E2Fc rekombinant fusjonsprotein

Immunofluorescens-kolokaliseringsanalyse ble utført for å bekrefte bindingen av BVDV-E2Fc-fusjonsproteinet til Fc RI på bovine alveolære makrofager (BAM). Kort fortalt ble 3 µg renset E2, E2Ft eller E2Fc tilsatt til bovine alveolære makrofager. Etter inkubasjon i 12 timer ved 37 ◦C, ble cellene vasket med 0.1 % BSA i fosfatbufret saltvann (PBS) og fiksert med metanol/aceton (1:1) ved 20 ◦ C. Celler ble deretter permeabilisert med 0,5 % Trition-X100 i 15 minutter og blokkert med 2 % BSA ved 37 ◦C i 2 timer. Deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS og inkubert med BVDV E2 monoklonalt antistoff (musekilde; fremstilt i vårt laboratorium) og bovint CD64 (Fc RI) polyklonalt antistoff (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, Kina) i 2 h. Cellene ble vasket tre ganger med PBS og dekket med Alexa Fluor® 488 geit-anti-muse-IgG (kat. nr. ab150113, Abcam, Cambridge, Storbritannia) og Cy3-merket geit-anti-kanin-IgG-antistoff (kat. nr. ab6939, Abcam, Cambridge, Storbritannia) i 1 time ved romtemperatur. Kjernene ble farget med DAPI. Bildene ble fotografert ved bruk av immunfluorescenskolokalisering (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

4.8. Bestemmelse av fagocytthastigheten til bovine alveolære makrofager

For å bestemme effekten av rekombinante proteiner E2, E2Ft og E2Fc på fagocytose av bovine alveolære makrofager (BAM), ble bovine alveolære makrofager i en konsentrasjon på 1 × 106 celler/ml pre-inkubert med rekombinante proteiner E2, E2Ft eller E2Fc (konsentrasjonene ble alle justert til 35 0 ng/ml) i 4 timer. Etter vask tre ganger med PBS, ble 10 µL FITC-konjugerte mikrosfærer (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) og 990 µL av RPMI-1640-mediet tilsatt til hver brønn . Etter 2 timers inkubering ble cellene vasket med PBS for å fjerne ekstracellulære FITC-konjugerte mikrosfærer. Adherente makrofager ble fordøyd med trypsin (Gibco) inneholdende 0,05 % EDTA, og fordøyelsen ble avsluttet med 1640 komplett medium etter full fordøyelse. Celler ble deretter tilsatt til det øverste laget av 10 ml PBS med 0,45 g glukose og 0,3 g BSA, etterfulgt av gradientsentrifugering ved 400 x g i 10 minutter. Separerte celler ble vasket to ganger med PBS og resuspendert med 800 ul PBS. Fluorescensintensitet ved 488 nm ble bestemt av Beckman flowcytometer (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, USA).

4.9. Vaksineforberedelse og immuniseringsprosedyre

HEK{{0}}uttrykt E2, E2Ft og E2Fc ble emulgert med IMS 1313VG adjuvans (Seppic, Frankrike) i like proporsjoner til en endelig proteinkonsentrasjon på 200 µg/ml, og lagret ved 4 ◦C etter kvalitets inspeksjon. BVDV-E0 og BVDV-E2 antistoffnegative (Kat. nr. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina) 3-måned gamle kalver (n=35) var delt inn i syv like grupper. Kalver i fire grupper ble immunisert nese-slimhinne (in) med henholdsvis PBS, E2, E2Ft og E2Fc. Kalver i de resterende tre gruppene ble injisert intramuskulært (im) med E2Ft-, E2Fc- og BVDV-inaktiverte vaksiner som positiv kontroll (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, Kina). Kalver ble vaksinert på dag 1, 21 og 35 av forsøket, og hver kalv ble inokulert med 1 ml vaksine med en proteinkonsentrasjon på 200 µg/ml. Blod ble samlet fra kalver på dag 1, 21, 35 og 49 av eksperimentet for andre indekser (figur 3A). Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av forskningsetisk komité ved College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Hubei, Kina (nr. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Produksjon av IgA i avføring og serum

Neseprøver, avføring og serumprøver fra kalver ble tatt på dag 14 etter den sekundære immuniseringen. Den ferske kuavføringen ble fortynnet i en 15 % fekal suspensjon med PBS, suspensjonen ble sentrifugert ved 18,000× g ved 4 ◦C i 30 minutter, og supernatanten ble samlet for senere bruk. Neseprøvene ble samlet ved å rotere den sterile bomullspinnen dypt inn i nesehulen til kua i 6–8 omdreininger. Vatter ble satt inn i et PBS-rør som inneholdt 1 % penicillin-streptomycin og blandet grundig. Prøver ble sentrifugert ved 18,000× g ved 4 ◦C i 10 minutter, og supernatanten ble samlet for senere bruk. Bovine blodprøver ble tatt med et etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)--holdig antikoagulantrør, og serumprøvene ble oppnådd ved å sentrifugere blodprøvene ved 4 ◦C og 400 g i 5 minutter. IgA (kat. nr. 177090b, CAMILO, Nanjing, Kina) og SIgA ble påvist med ELISA-settet (kat. nr. 177053b CAMILO, Nanjing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.

4.11. Flowcytometrianalyse

Frekvensen av IFN- -produserende CD3+ CD4+ og CD3+ CD8+ T-celler blant CD3+-lymfocyttene i blodet var analysert ved hjelp av flowcytometri. Prøver ble samlet 14 dager etter boosterimmuniseringen [36]. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble resuspendert og fortynnet til 1 × 106 celler/ml med komplett RPMI{10}}-medium, stimulert med UV-inaktivert BVDV XZ02 (MOI=0.1), og inkubert ved 37 ◦C med 5 % CO2 i 72 timer. Concanavalin A (Con A) (5 µg/ml; Sigma) ble brukt som en positiv kontroll. Proteintransporthemmeren brefeldin A (BFA, 3 µg/ml, eBioscience) ble tilsatt alle prøver 12 timer før cellehøsting for å blokkere IFN-sekresjon. En mengde på 200 µL av cellen ble overført til FCM-rør og farget med det FITC-merkede CD4-antistoffet (Kat. nr. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) i 30 minutter ved 4 ◦C i mørket. Etter å ha blitt vasket tre ganger med PBS, ble cellene inkubert med R-PE-merket CD8-antistoff (Kat. nr. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Etter å ha blitt vasket tre ganger, ble cellene inkubert med muse-anti-bovint IFN-antistoff (Cat NO. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) i 20 minutter i mørket for intracellulær cytokinfarging. Etter vasking ble cellene resuspendert i PBS inneholdende 1% FBS. Flowcytometri ble utført med FACS Caliber flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), og data ble samlet inn og analysert som tidligere beskrevet [38].

4.12. Lymfocyttproliferasjon og cytokindeteksjon

De antikoagulerte perifere mononukleære blodcellene (PBMC) fra hver kalv ble isolert ved bruk av et lymfocyttseparasjonsmedium (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) på dag 49 etter immunisering. Bovine perifere blodlymfocytter ble fortynnet med 10 % FBS 1640-medium til 1 × 106 celler/ml. Deretter ble 100 µL fortynnede celler tilsatt til hver brønn i en 96-brønnplate og stimulert med henholdsvis UV-inaktivert BVDV, concanavalin (positiv kontroll) eller kulturmedium (negativ kontroll). Etter 72 timers inkubering ved 37 ◦C med 5 % CO2, ble 30 µL MTS tilsatt til hver brønn, og cellene fortsatte å dyrkes ved 37 ◦C i 1 time i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen ved 492 nm ble målt med en automatisert mikroplateanalysator. Lymfocyttproliferasjonstiteren for hver prøve ble bestemt ved stimuleringsindeks (SI). Beregnet SI=(OD for prøve-OD for blindkontroll)/(OD for negativ prøve-OD for blindkontroll) [39]. Interferon (IFN)-, interleukin (IL)-2 og interleukin (IL)-4 ble påvist ved bruk av ELISA-sett. Kort fortalt ble PBMC-er isolert og fortynnet til 4 × 106 celler/mL med RPMI 1640-medium inneholdende 10 % FBS og plassert i 24-brønnvevskulturplater. Celler ble stimulert med inaktivert BVDV XZ02 (MOI=1) i 48 timer ved 37 ◦C, og supernatanten ble deretter samlet. IFN- (kat. nr. 177020b, CAMILO, Nanjing, Kina), IL-2 (kat. nr. 177028b, CAMILO, Nanjing, Kina) og IL-4 (kat. nr. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Kina) nivåer ble påvist ved bruk av tilsvarende ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Innholdet av IFN-, IL-2 og IL-4 i prøven ble beregnet ved å bruke standardkurven.

4.13. Serologiske tester

For å påvise E2/E0-antistoffer ble det tatt blodprøver fra hver kalv på dagene 0, 21, 35 og 49 etter immunisering. Serumprøver ble samlet ved å sentrifugere blodprøver ved 1000 x g i 20 minutter. Serumprøver ble behandlet i henhold til kravene til BVDV E2 antistoffdeteksjonssett (Kat. nr. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina). Mikroplater belagt med BVBV E2-antigenet ble ekvilibrert i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble 50 µL negativ kontroll, positiv kontroll og serumprøver tilsatt til henholdsvis mikroplaten. En mengde på 50 µL pepperrotperoksidase (HRP)-merket deteksjonsantistoff ble deretter tilsatt til mikroplaten og inkubert ved 37 ◦C i 60 minutter. Etter å ha blitt vasket fem ganger med en vaskebuffer, ble en kromogen løsning tilsatt for å måle absorbansen til mikroplateavleseren ved 450 nm for å bestemme nivået av E2-antistoff i hver immuniseringsgruppe. Den fikserte virusfortynningsserummetoden ble brukt for å påvise det nøytraliserende antistoffnivået i serumprøver. Kort fortalt ble de fullstendig inaktiverte immunserumprøvene fortynnet med 2−1 til 2−12, og 50 µL serum ved hver fortynningstiter ble tilsatt 96-brønnplater. Deretter ble 50 µL fortynnet virusløsning inneholdende 200 TCID50- BVDV XZ02-viruset tilsatt til hver brønn. Platene ble forsiktig ristet og blandet. Etter 1 times inkubering ved 37 ◦C, ble MDBK-celler med en konsentrasjon på 5 × 105 celler/ml tilsatt til 96-brønnplater og inkubert ved 37 ◦C i en fuktet inkubator med 5 % CO2 i 72 timer. For å påvise den nøytraliserende effekten av serumprøver, ble celler behandlet med det E2-spesifikke antistoffet som det primære antistoffet (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Storbritannia) og FITC-konjugert geit-anti-kanin-IgG som sekundært antistoff, (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Et typisk grønt fluorescerende signal indikerte fravær av nøytralisering. Fotografier ble tatt under et fluorescensmikroskop (TE2000, Nikon, Tokyo, Japan). Serumnøytraliseringstiteren ble beregnet i henhold til Reed–Muench-metoden og den maksimale fortynningen av serum som fullstendig kunne hemme fluorescens ble bestemt som nøytraliseringstiteren til serumet.

4.14. Spesifisitet Deteksjon av BVDV E2 monoklonalt antistoff

Pre-absorpsjonsanalyser av BVDV E2 monoklonalt antistoff ble først utført, etterfulgt av virale replikasjonsanalyser og Western blot for å vitne om spesifisiteten til BVDV E2 mAb. For viral replikasjonsanalyse ble 400 TCID50 av BVDV pre-inkubert med henholdsvis PBS og 100 µg eller 200 µg E2 mAb ved 37 ◦C i 1 time. Etter inkubering ble den forbehandlede BVDV inokulert til MDBK-celler, og cellene ble dyrket ved 37 ◦C i en fuktet inkubator. Celler ble samlet ved 18 eller 24 hpi (time etter infeksjon) og RNA ble ekstrahert med TRIZOL-reagens. RT-qPCR ble utført for å bestemme det relative uttrykket av BVDV E2-genet. For Western blot-analyse ble E2 mAb pre-inkubert med Tween20, PEDV S-protein eller BVDV E2-protein i TBS-T i henholdsvis 2 timer ved 4 ◦C. Forbehandlet E2-mAb ble utsatt for Western blot-analyse som det primære antistoffet for å påvise reaksjonen til BVDV E2- eller PEDV S-proteinet.

4.15. Statistisk analyse

Statistikkprogrammet GraphPad Prism ble brukt til alle analyser. Den to-hale uparede t-testen ble brukt til å analysere dataene og produsere p-verdiene (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Med mindre annet er angitt, vises data som gjennomsnitt ± SD.

5. Konklusjoner

I vår studie ble tre rekombinante proteiner, BVDV-E2, BVDV-E2Ft og BVDV-E2Fc, uttrykt, og tilsvarende underenhetsvaksiner ble generert. In vivo-tester viste at E2Fc-underenhetsvaksinen var mer effektiv enn E2Ft og E2, både i slimhinne- og intramuskulær immunisering. Vi bekreftet at de nøytraliserende antistofftitrene indusert av slimhinneimmuniserte E2Fc og E2Ft var henholdsvis 1:64 og 1:16, noe som ytterligere indikerer at E2Fc bandt med Fc RI på bovine alveolære makrofager for å oppnå transmukosal transport. Slimhinnevaksinering av den multivalente E2Fc-underenhetsvaksinen av den epidemiske hovedstammen av BVDV forbedret immuneffektene betydelig, og den er egnet for praktisk bruk. Vår studie gir en løsning på den tidkrevende og arbeidskrevende konvensjonelle vaksinasjonen ved å bruke en slimhinnevaksine. BVDV E2-protein er et ideelt mål for nøytralisering av antistoffer, og E2Fc- og E2Ft-fusjonsproteinene konstruert i denne studien forventes å bli ytterligere brukt som sikre og effektive underenhetsvaksiner mot BVDV-infeksjon.

Referanser

1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Utryddelsesprogram for bovint viralt diarévirus i Orknøyene 2001 til 2008. Vet. Rec. 2010, 167, 566–570. [CrossRef]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Et pestivirus som induserer toleranse for den medfødte immunresponsen. Biologi 2013, 41, 39–51. [CrossRef]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Genetisk typing og epidemiologisk observasjon av bovint viralt diarévirus i Vest-Kina. Virusgener 2011, 42, 204–207. [CrossRef]

4. Deng, Y.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Genomisk karakterisering av et bovint viralt diarévirus 1-isolat fra svin. Arch. Virol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Deng, Y.; Sun, CQ; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, H.; et al. Høy forekomst av bovint viralt diarévirus 1 i kinesiske svinebesetninger. Vet. Microbiol. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Song, C.; Bao, J.; Du, J. Opprinnelse og overføring av bovint viralt diarévirus type 1 i Kina avslørt ved fylodynamisk analyse. Res. Vet. Sci. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. The Molecular Biology of Pestiviruses. Adv. Virus Res. 2015, 93, 47–160.

8. Becher, P.; Tautz, N. RNA-rekombinasjon i pestivirus: Cellulære RNA-sekvenser i virale genomer fremhever rollen til vertsfaktorer for viral persistens og dødelig sykdom. RNA Biol. 2011, 8, 216–224. [CrossRef]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Krystallstruktur av glykoprotein E2 fra bovint viralt diarévirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2013, 110, 6805–6810. [CrossRef]

10. Williams, LBA; Fry, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP En rekombinant bovint herpesvirus-4 vektorert vaksine levert via intranasal forstøver fremkaller virale nøytraliserende antistofftitere hos storfe. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [CrossRef]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; et al. Humane immunresponser fremkalt av en intranasal inaktivert H5-influensavaksine. Microbiol. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Kjennetegn ved nasalassosiert lymfoidvev (NALT) og nasal absorpsjonskapasitet hos kylling. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Dere, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Effektiv slimhinnevaksinasjon mediert av den neonatale Fc-reseptoren. Nat. Bioteknologi. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Slimhinnevaksinasjon ved intranasal rute. Neseassosiert lymfoidvev (NALT) - Struktur, funksjon og artsforskjeller. Vaksine 2015, 33, 4406–4413. [CrossRef]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. En ny RSV F-Fc fusjonsproteinvaksine reduserer lungeskade indusert av respiratorisk syncytialvirusinfeksjon. Antivir. Res. 2019, 165, 11–22. [CrossRef]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Isotype-spesifikke utfall i Fc gamma-reseptormålretting av PspA ved bruk av fusjonsproteiner som en vaksinasjonsstrategi mot Streptococcus pneumoniae-infeksjon. Vaksine 2020, 38, 5634–5646. [CrossRef]

17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Pleas, RJ Fc-fusjonsproteiner: Nye utviklinger og fremtidsperspektiver. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015–1028. [CrossRef]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Optimalisering på Fc for forbedring av stabilitet og aggregasjonsmotstand. Curr. Pharm. Bioteknologi. 2016, 17, 1353–1359. [CrossRef]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, CA; Bailey, CR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, NJ; Barclay, WS; Jones, IM Adjuvansfri immunisering med hemagglutinin-Fc fusjonsproteiner som en tilnærming til influensavaksiner. J. Virol. 2011, 85, 3010–3014. [CrossRef]

20. Li, J.; Li, X.; Ma, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Fang, K.; Li, X.; Rong, Z.; et al. Effektiv slimhinnevaksinasjon av et nytt klassisk svinepestvirus E2-Fc-fusjonsprotein mediert av neonatal Fc-reseptor. Vaksine 2020, 38, 4574–4583. [CrossRef]

21. Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritins som nanoplattformer for bildebehandling og medikamentlevering. Ekspertuttalelse. Drug Deliv. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Selvmonterende proteinnanopartikler i utformingen av vaksiner. Comput. Struktur. Bioteknologi. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]

23. Jacob, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, CR Utvikling og anvendelse av syntetiske affinitetsligander for rensing av ferritinbaserte influensaantigener. Biokonjugat Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ma, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Song, Z.; et al. Nanopartikkelvaksiner basert på reseptorbindende domene (RBD) og heptad-repetisjon (HR) av SARS-CoV-2 fremkaller robuste beskyttende immunresponser. Immunitet 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Benedictus, L.; Bell, CR Risikoen ved bruk av allogene cellelinjer for vaksineproduksjon: Eksemplet på Bovin Neonatal Pancytopenia. Expert Rev. Vaccines 2017, 16, 65–71. [CrossRef]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; et al. Sikkerhet og effekt av en E2 glykoprotein underenhetsvaksine produsert i pattedyrceller for å forhindre eksperimentell infeksjon med bovint viralt diarévirus hos storfe. Vet. Res. Commun. 2012, 36, 157–164. [CrossRef]

27. Thomas, C.; Young, NJ; Heaney, J.; Collins, ME; Brownlie, J. Evaluering av effekten av pattedyr- og baculovirusuttrykte E2-underenhetsvaksinekandidater mot bovint viralt diarévirus. Vaksine 2009, 27, 2387–2393. [CrossRef]

28. Arena, TA; Harms, PD; Wong, AW High Throughput Transfection of HEK293 Cells for Transient Protein Production. Metoder Mol. Biol. 2018, 1850, 179–187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilbert, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henry, O.; Kamen, A. Hemagglutinin og neuraminidase som inneholder viruslignende partikler produsert i HEK-293 suspensjonskultur: En effektiv influensavaksinekandidat. Vaksine 2016, 34, 3371–3380. [CrossRef]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Molekylær kloning og identifikasjon av full-lengde cDNA som koder for høyaffinitets Fc-reseptor for bovint IgG (Fc gamma RI). Vet. Immunol. Immunopatol. 2000, 75, 151–159. [CrossRef]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Fang, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. En selvmonterende ferritin-nanoplattform for utforming av klassisk svinepestvaksine: fremkalling av kraftig nøytraliserende antistoff. Vaksiner 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, MIN; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; et al. Intranasal vaksinasjon med rekombinant antigen-FLIPr fusjonsprotein alene induserer langvarige systemiske antistoffresponser og brede T-celleresponser. Front. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. En ny MHC-II-målrettet BVDV-underenhetsvaksine induserer en nøytraliserende immunologisk respons hos marsvin og storfe. Transbound. Emerg. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ma, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. Immunisering med en rekombinant fusjon av porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus modifisert GP5 og ferritin fremkaller forbedret beskyttende immunitet hos griser. Virology 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, MP; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; et al. Konstruere en stabil CHO-cellelinje for ekspresjon av et MERS-koronavirus-vaksineantigen. Vaksine 2018, 36, 1853–1862. [CrossRef]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Colombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; et al. Konstruerte ferritin-nanopartikler for bioluminescenssporing av nanodroglevering i kreft. Liten 2020, 16, e2001450. [CrossRef]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Glykoprotein E2 fra klassisk svinepestvirus uttrykt av baculovirus induserer de beskyttende immunresponsene hos kaniner. Vaksine 2014, 32, 6607–6613. [CrossRef]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Zhang, W.; Saif, LJ Virusspesifikke intestinale IFN-gamma-produserende T-celleresponser indusert av human rotavirusinfeksjon og vaksiner er korrelert med beskyttelse mot rotavirusdiaré hos gnotobiotiske griser. Vaksine 2008, 26, 3322–3331. [CrossRef]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Forbedret beskyttende immunrespons mot PCV2-underenhetsvaksine ved samtidig administrering av rekombinant svine-IFN-gamma i mus. Vaksine 2013, 31, 833–838. [CrossRef]