Hydrogensulfid demper nyre-I/R-indusert aktivering av inflammatorisk respons og apoptose via regulering av Nrf2-mediert NLRP3-hemming av signalveien
Mar 14, 2022
Abstrakt. Nyreiskemi/reperfusjon (I/R) skade kan føre til akuttnyresvikt, forsinket graftfunksjon og graftavvisning. Nukleotidbindende oligomeriseringsdomene NOD-lignende reseptor som inneholder pyrindomene 3 (NLRP3)-mediert betennelse deltar i utviklingen avnyreskade. Nrf2 akselererer NLRP3-signalveiaktivering og regulerer den inflammatoriske responsen ytterligere. I tillegg tjener hydrogensulfid en beskyttende rolle inyreskade; Den detaljerte underliggende mekanismen er imidlertid fortsatt dårlig forstått. Denne studien undersøkte om Nrf2- og NLRP3-veier deltar i hydrogensulfidregulertenyreI/R-indusert aktivering av den inflammatoriske responsen og apoptose. Villtype- og Nrf2-knockout-mus (KO) gjennomgikk kirurgi for å induserenyreI/R via fastspenning av bilateralennyrepedikler. Totalt 20 mg/kg MCC950 (en NLRP3-hemmer) ble injisert intraperitonealt daglig i 14 dager før operasjonen.Nyrevev og blod ble samlet inn fra I/R-modellmusene for å analysere NLRP3- og Nrf2-mRNA-ekspresjonsnivåer, NLRP3-, PYD- og CARD-domeneholdig, caspase-1, IL-1, Nrf2 og heme oksygenase 1-proteinekspresjonsnivåer, celleapoptose, sekresjon av tumornekrosefaktor-, IL-1 og IL-6 cytokiner ognyrehistopatologi og funksjon.NyreI/R aktiverte signalveiene NLRP3 og Nrf2. Motsatt hemmet MCC950-behandling aktivering av NLRP3-signalveien og forhindret I/R-indusertnyreskade, frigjøring av cytokiner og apoptose inyreI/R-modellmus. Natriumhydrosulfid (NaHS) lindret ikke bare oppregulering av NLRP3-proteinekspresjonsnivåer, men lindret ogsånyreskade,frigjøring av cytokiner og celleapoptose indusert av nyre-I/R hos villtypemus, men ikke hos Nrf2-KO-mus. NaHS lindret NLRP3-inflammasomaktivering,nyreskade,inflammatorisk respons og celleapoptose via Nrf2-signalveien i nyre-I/R-modellmus.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFEILT
Introduksjon
Nyreiskemi/reperfusjon (I/R) er en ledende årsak til akuttnyreskade(AKI) som vanligvis oppstår undernyrekirurgi og disponerer individer for alvorlig dysfunksjon i flere organsystemer. I/R-indusert celledød og betennelse innenfornyrevev er assosiert med komplekse patofysiologiske prosesser og fremmer nedgangen inyrefunksjon,og dermed føre til akkumulering av metabolske avfallsprodukter (1). I tillegg til iskemi-indusertnyrevevsskade, har reperfusjon også vist seg å utløse en kompleks patofysiologisk kaskade som involverer overdreven frigjøring av frie radikaler og akkumulering av inflammatoriske celler, som deretter fremmer betennelse og ytterligere forverrer lokal iskemi og cellulær skade (2).
Underfamilier av det nukleotidbindende domenet og den leucinrike gjentakende familien spiller en nøkkelrolle i utviklingen av den inflammatoriske responsen (3). NLR-familiens pyrindomene inneholder 3 (NLRP3) inflammasom (tidligere kjent som NACHT-, LRR- og PYD-domener som inneholder protein 3 og kryopyrin) er det mest karakteriserte inflammasomet til dags dato. Et økende antall studier har rapportert en sammenheng mellom NLRP3 ogrenal I/R. I AKI er NLRP3 involvert inyreI/R-skade (4,5). For eksempel lindrer knockdown av NLRP3 og dens adapter PYD og CARD domeneholdig (ASC) I/R-indusertnyredysfunksjon og overdreven nøytrofiltilstrømning tilnyrevev(6). I tillegg beskytter knock-down av NLRP3 og/eller caspase-1 mus mot AKI indusert av sepsis eller lipopolysakkarid (7,8). Disse funnene tyder på at NLPR3-inflammasomet kan tjene en nøkkelrolle i patogenesen avnyreskade.
Nrf2 er et endogent antioksidantgen, lokalisert i cytosolen, som kombineres med Kelch-lignende ECH-assosiert protein 1 (Keap). Når den er aktivert, frigjøres Nrf2 fra Keep og translokerer inn i kjernen, hvor den deretter binder seg til antioksidantresponselementer for å starte transkripsjonen av dets nedstrøms antioksidant- og cytobeskyttende målgener, slik som superoksiddismutase, katalase, glutationperoksidase, glutation-transferase-S-S- isozymer, katalytiske og modifiserende underenheter av ‑glutamylcysteinligase og NADP(H): Kinonoksidoreduktase (9). Det ble tidligere rapportert at Nrf2 er assosiert med AKI indusert av miljøfornærmelse, iskemi eller fremmedfrykt(10). Bortsett fra dens rapporterte beskyttende rolle i vevsskade, har tidligere studier også vist at overekspresjon av Nrf2 undertrykker NLRP3-inflammasomaktivitet og forbedrer vevsskade (11-13). Imidlertid er den underliggende mekanismen til Nrf2-signalveien og dens effekt på NLRP3-inflammasomaktivering inyreI/R forblir ukjent.Hydrogensulfid (H2S) har fått anerkjennelse for sin evne til å regulere pattedyrs homeostase og fundamentale celleprosesser, som autofagi (14). En rekke studier har rapportert at H2S har en beskyttende rolle mot apoptose, oksidativt stress og betennelse inyreskade(15–20). Ikke desto mindre er den underliggende beskyttelsesmekanismen til H2S inyreskadeindusert av I/R forblir ukjent. Derfor undersøkte denne studien ekspresjonsnivåene til NLRP3 og dens adapter, ASC, i nyre-I/R-modellmus, og bestemte deretter effekten av Nrf2 på NLRP3-ekspresjon. Denne studien hadde også som mål å avgjøre om H2S beskytternyrevevimotnyreskade,betennelse og apoptose via Nrf2-mediert NLRP3-hemming.
Nøkkelord:nyreiskemi/reperfusjonsskade, Nrf2, hydrogensulfid, apoptose, nyreskade; nyresvikt
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM
Materialer og metoder
Etablering av renal I/R modell og behandlingsgrupper.Totalt 24 villtype hannmus (vekt, 20-25 g; alder, 6-8 uker) ble hentet fra Laboratory Animal Center ved Academy of Military Medical Sciences (Beijing, Kina). I tillegg ble ni Nrf2-knockout (KO) hannmus (vekt, 20-25 g; alder, 6-8 uker) hentet fra Junke Biological Co., Ltd. Alle dyreprotokoller ble godkjent av Animal Care and Use Committee of General Hospital ved Tianjin Medical University (godkjenningsnr. IRB2020-DW-04; Tianjin, Kina), og alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyrs lidelse og antall dyr som ble brukt. Musene ble akklimatisert til miljøet i 3 dager før eksperimentet ved 22˚C med 40-60 prosent fuktighet, en 12-timers lys/mørke-syklus og fri tilgang til vann og gnagermat. Etter at mus ble bedøvet med intraperitoneal (ip) 50 mg/kg natriumpentobarbital, ble den bilateralenyrepedikler ble ligert i 30 minutter ved bruk av mikroaneurismeklemmer. Deretter ble mikroaneurismeklemmene fjernet. I kontrollgruppen ble kirurgi utført ved bruk av samme prosess; men,nyrepedikler ble ikke ligert. Etter operasjonen ble 0,9 prosent natriumkloridløsning brukt for å hjelpe mus til å komme seg. Mus ble deretter avlivet etter reperfusjon i 24 timer. Totalt 24 villtype mus ble tilfeldig delt inn i følgende seks grupper: i) Kontroll (Con) gruppe (n=9); ii) I/R-gruppe (n=9); iii) I/R pluss MCC950-gruppe (n=3); og iv) I/R pluss NaHS-gruppe (n=3). Totalt ni Nrf2‑KO-mus ble tilfeldig delt inn i følgende tre grupper: i) Con-gruppe (n=3); ii) I/R-gruppe (n=3); og iii) I/R pluss NaHS-gruppe (n=3).
I følge tidligere forskning og foreløpige eksperimenter (21,22), ble 20 mg/kg MCC950 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) injisert (ip) daglig i 14 dager før operasjonen i I/R pluss MCC950 gruppe. Totalt 50 µmol/kg natriumhydrosulfid [NaHS; ip; fortynnet i normalt (0,9 prosent) saltvann; Sigma-Aldrich; Merck KGaA] ble injisert før operasjonen i I/R pluss NaHS-gruppen. Når alle eksperimentelle prosedyrer var fullført, ble mus ofret ved cervikal dislokasjon og vev og blod ble samlet for påfølgende analyse.
Western blotting. Nyrevevble samlet fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon for å analysere proteinekspresjonsnivåer. Kort fortalt ble total- og nukleinprotein ekstrahert ved bruk av RIPA-buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.) og proteinkonsentrasjon ble bestemt ved bruk av et BCA Protein Assay-sett (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Totalt 40 µg protein per bane ble separert via 10 prosent SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluoridmembraner, deretter blokkert med 5 prosent melk i 2 timer ved romtemperatur. Membranene ble deretter inkubert med følgende primære antistoffer over natten ved 4˚C: Anti‑NLRP3 (1:500; kat.nr. ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; kat.nr.sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-caspase-1 (1:200; kat.nr. sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1,000; kat . nr. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1,000; kat.nr. ab137550; Abcam), anti-hem oksygenase (HO)-1 (1:2,000 ; kat.nr. ab68477; Abcam), anti‑ ‑aktin (1:2,000; kat.nr. ab8227; Abcam) og anti-histon H3 (1:2,000; katt . nr. ab176842; Abcam). Etter inkubering av primær antistoff ble membranene inkubert med de tilsvarende HRP-konjugerte sekundære antistoffene (1:5,000; kat.nr. ab6721 og ab6728; begge Abcam) i 1 time ved romtemperatur. Proteinbånd ble visualisert med et forbedret kjemiluminescenssett (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ved bruk av et Bio-Imaging-system (Bio-Rad Laboratories, Inc.) og semikvantifisert ved hjelp av Quantity One (V4.6) programvare (Bio-Rad Laboratories) , Inc.). Proteinekspresjonsnivåer ble normalisert til -aktin for cytoplasmatisk protein eller histon for nukleinprotein.
Omvendt transkripsjon-kvantitativ(RT‑q)PCR.Nyrevevble samlet fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon for å analysere mRNA-ekspresjonsnivåer. Kort fortalt ble totalt RNA ekstrahert fra vev ved å bruke TRIzol®-reagens (kat.nr. 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Totalt RNA ble omvendt transkribert til cDNA ved bruk av et RevertAid First Strand cDNA-syntesesett (kat.nr. K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) i henhold til produsentens protokoll. qPCR ble deretter utført ved bruk av SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) på et 7500 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Termosykleringsbetingelsene var som følger: Denaturering ved 95°C i 5 minutter; 40 sykluser ved 95˚C i 15 sekunder; og forlengelse ved 60˚C i 20 sek. De genspesifikke primersekvensene er oppført i tabell I. De relative ekspresjonsnivåene til målgenene ble beregnet ved bruk av 2-ΔΔCq-metoden (23) og normalisert til GAPDH-ekspresjonsnivåer.
Immunhistokjemi (IHC). Nyrevevble samlet fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon for å bestemme NLRP3- og Nrf2-ekspresjonsnivåer. Kort,nyrevev ble fiksert ved romtemperatur i 48 timer i 10 prosent formalin, innebygd i parafin og kuttet i 5 µm seksjoner. Seksjonene ble deretter blokkert med 5 prosent melk ved 37˚C i 30 minutter og inkubert med anti-NLRP3 (1:100; kat.nr. ab214185; Abcam) eller anti-Nrf2 (1:200; kat.nr. ab137550; Abcam) primære antistoffer over natten. Etter inkubering av primær antistoff ble seksjonene inkubert med HRP-merket sekundært anti-kanin antistoff (1:200; kat.nr. ab214880; Abcam) ved 37˚C i 30 minutter, utviklet ved bruk av diaminobenzidinløsning for<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Nyrefunksjonsanalyse. Totalt 2-3 ml blod ble samlet etter sentrifugering ved 3,000 xg i 10 minutter ved 4˚C fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon. Serumet ble oppnådd for å analyserenyrefunksjonvia ELISA for å bestemme nivåer av kreatinin (kat.nr. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) og blod urea nitrogen (BUN; kat.nr. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), i henhold til produsentens instruksjoner.Nyreskademolekyl-1 (KIM-1) nivåer i serum ble målt med ELISA (kat.nr. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) i henhold til produsentens instruksjoner.
Hematoxylin og eosinfarging.Nyrevevble samlet fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon for å evaluerenyrehistopatologiske endringer. Vevet ble fiksert ved romtemperatur i 48 timer i 10 prosent formalin og deretter innebygd i parafin. Parafininnstøpte seksjoner ble kuttet i 5 µm tykke seksjoner og farget med 0,5 prosent hematoksylin i 5 minutter og eosin i 3 minutter ved romtemperatur (25˚C). Tilstedeværelsen av blødning, tubulær cellenekrose, tubulær dilatasjon og cytoplasmatisk vakuoldannelse i vevet ble skåret som følger: 0, normalnyre;1, minimal skade; 2, moderat skade; og 3, alvorlig skade (24).Nyreskadescore ble beregnet på en blind måte av to forskere under et lysmikroskop (forstørrelse, x200; Biorevo BZ-9000; Keyence Corporation).
ELISA-analyse av TNF‑, IL‑1 og IL‑6 nivåer. Blod ble samlet (1 ml) fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon. Serumet ble oppnådd ved sentrifugering ved 3,000 xg i 10 minutter ved 4˚C. Serumnivåene av TNF‑ (kat.nr. MTA00b), IL-1 (kat.nr. MLB00C) og IL-6 (kat.nr. M6000B) ble analysert ved hjelp av kommersielle ELISA-sett (R&D Systems, Inc.), i henhold til produsentens protokoll på en mikroplateleser (kat.nr. CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON
TUNEL-farging.Nyrevevble samlet fra I/R-modellmus etter 24 timers reperfusjon for å evaluere celleapoptose ved bruk av TUNEL-farging. Kort fortalt ble vev fiksert ved romtemperatur i 48 timer i 10 prosent formalin, innebygd i parafin og kuttet i 5-µm tykke seksjoner. Seksjoner ble inkubert med TUNEL-reagens i et fuktet kammer ved 37˚C i 60 minutter i mørket (Roche Diagnostics) og farget med DAPI i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble 10 høyeffektmikroskopfelt tilfeldig plukket ut og observert i hver seksjon med et fluorescensmikroskop (forstørrelse, x10).Statistisk analyse. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter og ble analysert med GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Statistiske forskjeller mellom to grupper ble analysert ved hjelp av en sammenkoblet Students t-test. Statistiske forskjeller mellom mer enn tre grupper ble analysert ved å bruke enveis ANOVA etterfulgt av post hoc Tukeys test for flere sammenligninger. Alle data var normalfordelt og hadde lik varians. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultater
MCC950-behandling forhindrer etterfølgende I/R-indusert NLRP3-signalaktiveringnyreskadehos mus. NLRP3-inflammasomveien er aktivert og spiller en avgjørende rolle inyreskade(25,26). En tidligere studie rapporterte også at NLRP3-signalering er aktivert i nyrevev hos mus 24 timer etter reperfusjon (4). Derfor ble 24 timer etter reperfusjon valgt som nåværende vurderingstidspunkt. NLRP3-proteinekspresjonsnivåer ble oppregulert av nyre-I/R-skade i I/R-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (Con) (fig. 1A og B). En lignende trend ble observert i NLRP3 mRNA-ekspresjonsnivåer (fig. 1C). Videre økte antallet NLRP3-positive celler i I/R-gruppen sammenlignet med Con-gruppen, bestemt ved IHC-farging (fig. 1D og E).
For å bestemme den underliggende mekanismen for NLRP3-inflammasomaktivering og effekten på nedstrøms signalvei etter nyre-I/R-skade, ble mus behandlet med NLRP3-hemmeren MCC950. Western blotting-resultater viste at I/R oppregulerte proteinekspresjonsnivåer av NLRP3 og dets adapter ASC og fremmet modning fra pro-caspase-1 til caspase-1 og pro-IL-1 til IL-1 i I/R-gruppen sammenlignet med Con-gruppe (fig. 2A-E). Disse resultatene indikerte at nyre-I/R kan indusere aktivering av NLRP3-inflammasomveien, og behandling med MCC950 kan nedregulere NLRP3-, ASC-, caspase-1- og IL-1-ekspresjonsnivåer etter nyre-I/R-skade.
Effekt av NLRP3-inflammasomet pånyreskade, betennelse og apoptose i nyre-I/R-modellmus. For å
bestemme effekten av NLRP3 på nyreskade, ble I/R-modellmus behandlet med NLRP3-hemmeren MCC950. Nyre-I/R-modellmus viste signifikant økte nivåer av BUN, serumkreatinin og KIM-1, som er en biomarkør for nyreskade (fig. 3A-C), som indikerer vellykket induksjon av nyre-I/R-skade. Histologisk undersøkelse av nyrevev fra I/R-modellmus avslørte økt histologisk poengsum, noe som ble påvist av alvorlig tubulær epitelhevelse, tubulær dilatasjon og interstitielt ødem, vakuolar degenerasjon og tap av børstekanten, noe som antydet at nyre-I/R kan fremme betydelig nyrevevsskade og økt histologisk skår (fig. 3D og E). Hemming av NLRP3 ved MCC950-behandling reduserte signifikant I/R-induserte økninger i BUN-, kreatinin- og KIM-1-nivåer og reduserte histologisk poengsum, med nyrevev som viste færre alvorlig skadde tubuli (fig. 3A-E).
I tillegg ble nivåer av inflammatoriske faktorer og apoptotiske celler etter MCC950-administrasjon analysert i nyre-I/R-modellmus. Indikatorer for betennelse, inkludert TNF‑, IL‑1 og IL‑6, var signifikant oppregulert i I/R-gruppen sammenlignet med Con-gruppen (fig. 3F‑H). I tillegg, sammenlignet med Con-gruppen, var prosentandelen av apoptotiske celler betydelig økt 24 timer etter reperfusjon i I/R-gruppen (fig. 3I og J). Sammenlignet med I/R-gruppen ble sekretoriske nivåer av cytokiner, TNF‑, IL‑1 og IL‑6, og prosentandelen av apoptotiske celler redusert ved MCC950-behandling i I/R pluss MCC950-gruppen (fig. 3F‑J) ). Disse resultatene indikerte at hemming av NLRP3-inflammasomet kan forhindre frigjøring av inflammatoriske faktorer og apoptose av nyrevev indusert av I/R.
Nrf2 er avgjørende for nyre-I/R-indusert regulering av NLRP3-inflammasomaktivitet.En tidligere studie viste at Nrf2 er aktivert og ekspresjonsnivåer av Nrf2 målgener er oppregulert inyrevevetter nyre-I/R-skade (27). Lignende funn ble oppnådd i denne forskningen. Nuklein-, totalprotein- og mRNA-ekspresjonsnivåer av Nrf2 ble analysert 24 timer etter nyre-I/R-skade. Resultatene viste at, sammenlignet med Con-gruppen, var nuklein-, totalprotein- og mRNA-ekspresjonsnivåene til Nrf2 oppregulert i I/R-gruppen (fig. 4A-D). I tillegg fant IHC-analyse at ekspresjonsnivåer av Nrf2 i nyrevev ble økt, noe som ble demonstrert av det økte antallet Nrf2-positive
celler observert i I/R-gruppen (fig. 4E og F). Disse dataene antydet at aktivering av Nrf2-signalveien kan starte en beskyttende respons hos nyre-I/R-modellmus. For å verifisere effekten av Nrf2 på NLRP3-inflammasomveien i nyre-I/R, ble Nrf2-KO-mus brukt i påfølgende eksperimenter. Proteinekspresjonsnivåer av Nrf2 og dets målgen, HO-1, ble signifikant nedregulert etter renal I/R i KO-mus sammenlignet med villtypemus (fig. 5A-C). Omvendt, sammenlignet med I/R villtypegruppen, ble ekspresjonsnivåene til NLRP3 og dens adapter, ASC, caspase-1 og IL-1 oppregulert i I/R KO-gruppen (fig. 5A og D-G). Disse dataene indikerte at nyre-I/R kan indusere aktivering av NLRP3-inflammasomet i Nrf2-KO-mus.
NaHS lindrer I/R-indusert oppregulering av NLRP3-proteinekspresjonsnivåer i villtype, men ikke i Nrf2-KO, mus. NaHS har vist seg å ha effekter på Nrf2-uttrykk og NLRP3-inflammasomaktivering i forskjellige sykdomsmodeller (28-30). Denne studien undersøkte om effekten av NaHS på aktivering av NLRP3-banen skjer via Nrf2-signalveien ved å analysere ekspresjonsnivåerav Nrf2 og NLRP3 inflammasomassosierte proteiner i villtype- og KO-mus.Hos villtype mus, sammenlignet med Con-gruppen, ble ekspresjonsnivåene av Nrf2, NLRP3, caspase-1 og IL-1 oppregulert av nyre-I/R-skade. I tillegg oppregulerte NaHS-behandling Nrf2-ekspresjon ytterligere og nedregulerte NLRP3-, caspase-1- og IL-1-ekspresjonsnivåer i I/R pluss NaHS-gruppen sammenlignet med I/R-gruppen (fig. 6A-E). Hos Nrf2-KO-mus ble det ikke observert noen statistisk signifikante forskjeller i ekspresjonsnivåene Nrf2, NLRP3, caspase-1 og IL-1 mellom I/R- og I/R pluss NaHS-gruppene (fig. 6A-E). I I/R pluss NaHS-gruppen ble Nrf2-ekspresjonsnivåene signifikant nedregulert, mens NLRP3-, caspase-1- og IL-1-ekspresjonsnivåene ble signifikant oppregulert i Nrf2-KO-mus sammenlignet med villtypemus. Disse resultatene antydet at NaHS kan redusere NLRP3-inflammasomaktivering via Nrf2-signalveien ved nyre-I/R-skade
NaHS lindrer nyreskade, betennelse og apoptose via Nrf2-signalveien i nyre-I/R-modellmus. NaHS har en viktig rolle ved nyreskade i AKI, I/R og andre sykdomsmodeller (31). NaHS lindret renal I/R-indusert histopatologisk skade, som ble demonstrert ved redusert tubulær epitelhevelse, tubulær dilatasjon og interstitielt ødem ognyrehistologiske skårer i I/R pluss NaHS-gruppen sammenlignet med I/R-gruppen i villtypemus (fig. 7A og B). Indikatorer for nyrefunksjon, inkludert kreatinin, BUN og KIM‑1, ble også redusert ved NaHS-behandling i I/R pluss NaHS-gruppen sammenlignet med I/R-gruppen i villtype
mus (fig. 7C-E). Hos Nrf2-KO-mus var imidlertid NaHS ikke i stand til å redusere økningennyrehistologisk poengsum og nivåer av nyrefunksjonsindikatorer indusert av nyre-I/R. Videre ble prosentandelen av apoptotiske celler og frigjøring av cytokiner, TNF‑, IL‑1 og IL‑6, alle redusert etter NaHS-behandling i I/R pluss NaHSgruppen sammenlignet med I/R-gruppen i villtypemus (fig. 7F-J). Imidlertid var NaHS ikke i stand til å utøve en beskyttende effekt mot apoptose og overdreven frigjøring av inflammatoriske faktorer etter reperfusjon av nyrevev i I/R pluss NaHS-gruppen av Nrf2-KO-mus sammenlignet med I/R pluss NaHS villtypemus (fig. 7F-J). Disse resultatene antydet at NaHS kan lindre nyreskade, betennelse og apoptose hos nyre-I/R-villtypemus, men ikke hos Nrf2-KO-mus.
Diskusjon
Betennelse er en nøkkelpatogen prosess av AKI indusert av I/R (4). NLRP3-inflammasom- og Nrf2-signalveien deltar i reguleringen av betennelse inyreskade(32). Denne studien fant at AKI indusert av I/R aktiverte NLRP3-inflammasomet og dets adapter, ASC, fremmet modningen av pro-caspase-1 og pro-IL-1 og akselererte overdreven frigjøring av cytokiner og apoptose, som kulminerte i alvorlig nyre dysfunksjon. Hemming av NLRP3-inflammasomet ved MCC950-behandling forbedret nyrefunksjonen, nivåene av betennelse og apoptose i nyrevev. I tillegg til å aktivere NLRP3, aktiverte nyre-I/R også Nrf2-signalveien. Imidlertid førte fraværet av Nrf2 i Nrf2-KO-mus til ytterligere oppregulering av NLRP3-inflammasomet og dets adapter. NaHS-behandling ble funnet å lindre NLRP3-inflammasomaktivitet via Nrf2-signalveien. Dessuten ble nyreskade, betennelse og apoptose redusert ved NaHS-behandling via Nrf2-mediert hemming av NLRP3-inflammasomaktivering.
Nyre I/R-skade er et viktig klinisk problem og primær årsak til AKI, som fører til økt risiko for å utvikle kronisknyresykdom(33). Betennelse er et viktig patologisk trekk ved iskemisk skade og oppstår som en konsekvens av immuncelleaktivering via gjenkjennelse av patogen- og skadeassosierte molekylære mønstre (34). Dessuten ble det tidligere rapportert at NLRP3-inflammasomet har en rolle i en rekkenyresykdommerved å regulere inflammasjon, pyroptose, apoptose og fibrose (35). NLRP3-inflammasomet er et proteinkompleks som omfatter NLRP3, dets adapterprotein, ASC og caspase-1. Caspase-1 spalter pro-IL-1 og pro-IL-18 til modne, aktiverte sekretoriske former. Nyreskade indusert av forskjellige patologier, inkludert iskemi (33), aktiverer inflammasomkomplekset, oppregulerer NLRP3-ekspresjon og fremmer den påfølgende modningen av pro-IL-1 (36). NLRP3 KO ved bruk av lite interfererende RNA i mus eller renale tubulære epitelceller utøver en beskyttende effekt mot nyrevevsskade indusert av iskemi eller celleskade i fravær av glukose (37). De nåværende resultatene indikerte at nyre-I/R induserte aktivering av NLRP3-inflammasomet, mens hemming av NLRP3 ved bruk av MCC950 signifikant nedregulerte NLRP3- og ASC-ekspresjonsnivåer og modningen av pro-caspase-1 og pro-IL-1 i nyre-I/R. skademodell. I tillegg forbedret NLRP3-hemming av MCC950 nyredysfunksjon, og reduserte histopatologisk skade og poengsum, overdreven frigjøring av cytokiner og antall apoptotiske celler. Disse dataene antydet at NLRP3-aktivering kan tjene en nøkkelrolle ved nyreskade, og hemming av NLRP3 kan ha en beskyttende effekt mot vevsskade og dysfunksjon indusert av nyre-I/R.
Tidligere studier har rapportert at Nrf2 deltar i den inflammatoriske responsen (10-12). I tillegg har Nrf2 en viktig anti-inflammatorisk, antioksidativ eller anti-apoptotisk rolle i iskemiske tilstander. Nrf2/antioksidant respons element signalvei aktivering demper betennelse og apoptose i nyrevev fra cyklofosfamid-induserte mus (38). En annen studie viste at Nrf2-aktivering av sulforafan hemmer NF‑κB signalveiaktivitet, og dermed lindrer betennelse i dystrofisk muskelvev (39). Videre fremmer knockdown av Nrf2 NLRP3-inflammasomaktivering og fører til IL-1-aktivering i en iskemimodell (11). De nåværende dataene støttet funnene om at nyre-I/R kan indusere Nrf2-signalveien og uttrykk for dens nedstrøms målgener, slik som HO-1. Nrf2-KO-mus fremmet ytterligere aktivering av NLRP3-inflammasomet, noe som indikerte at NLRP3, ASC, caspase-1 og IL-1 ekspresjonsnivåer ble økt i den renale I/R-modellen. Disse resultatene antydet at Nrf2 utøvde en hemmende effekt på NLRP3-inflammasomaktivering ved nyre-I/R-skade.
Tidligere forskning har rapportert atnyreproduserer H2S (40). Videre øker H2S renal blodstrøm og fremmer clearance-funksjonen tilnyre, som demonstrert av en forhøyet glomerulær filtrasjonshastighet (41). Dessuten lindrer H2S ikke bare betennelse og oksidativt stress, men har også en avgjørende rolle i å regulere endoteldysfunksjon og hypertensjon (28). H2S deltar i reguleringen av nyreassosierte sykdommer, som I/R-skade og obstruktiv og diabetisk nefropati (42), men de underliggende mekanismene er fortsatt dårlig forstått. NHS har blitt brukt som en H2S-eksogen donor i forskning (43). I denne studien var leveringen av H2S i form av NaHS. De nåværende resultatene viste at NaHS forbedret vevsskade,nyredysfunksjon, overdreven frigjøring av cytokiner og apoptose indusert av renal I/R. Det ble tidligere rapportert at NaHS forhindrer mikroglial aktivering og betennelse indusert av nerveskade via regulering av Nrf2-signalveien (44). I samsvar med hypotesen om at NaHS regulerer betennelse via Nrf2-signalveien, viste de nåværende resultatene at NaHS oppregulerte Nrf2-ekspresjonsnivåer og hemmet ekspresjonsnivåer av NLRP3 i nyre-I/R-modellmus. Videre avskaffet Nrf2 KO de regulatoriske effektene av NaHS på Nrf2 og NLRP3-inflammasomet. Denne studien undersøkte også rollen til Nrf2 på nyreskade og funksjon etter NaHS-behandling; hemming av Nrf2 reverserte ikke bare delvis den beskyttende effekten av NaHS pånyreskadeog dysfunksjon, men reverserte også den hemmende effekten av NaHS på den inflammatoriske responsen og apoptose etter nyre-I/R. Disse resultatene antydet at Nrf2 kan være nødvendig for den beskyttende effekten av NaHS på AKI indusert av I/R, og NaHS kan utøve sin beskyttende rolle mot vevsskade via Nrf2-mediert NLPR3-inflammasomhemming. Som konklusjon aktiverte I/R-indusert nyreskade NLRP3-inflammasom- og Nrf2-signalveien, og hemming av NLRP3-inflammasomet beskyttet mot nyreskade. Nrf2 negativt regulert NLRP3-inflammasomaktivering og NaHS lindretnyreskadeog dysfunksjon, apoptose og den inflammatoriske responsen via Nrf2-mediert NLRP3-inflammasomhemming. Disse resultatene gir ny innsikt i et potensielt fremtidig mål for behandling av iskemisk nyreskade.