Hvorfor Retinoic Acid Receptor Responder1 kan fremme utvikling av glomerulære sykdommer?

Retinoic Acid Reseptor Responder1 fremmer utvikling av glomerulære sykdommer via Nuclear Factor-kB Signaling Pathway

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4 , Mark Lal5 og Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrated Cardio Metabolic Centre, Karolinska Institutet ved Karolinska Universitetssykehuset, Huddinge, Stockholm, Sverige; 2 Avdeling for laboratoriemedisin, avdeling for patologi, Karolinska Institutet ved Karolinska Universitetssykehuset, Huddinge, Stockholm, Sverige; 3 Medisinsk avdeling Huddinge, Karolinska Institutet ved Karolinska Universitetssykehuset, Huddinge, Stockholm, Sverige; 4 Institutt for kliniske vitenskaper, intervensjon og teknologi, avdeling for nyremedisin, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige; og 5 Biovitenskap Nyre, forskning og tidlig utvikling Kardiovaskulær, nyre og metabolisme (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Gøteborg, Sverige

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Copyright ª 2021, International Society of Nephrology. Publisert av Elsevier Inc. Dette er en åpen artikkel under CC BY-lisensen

Korrespondanse: Jaakko Patrakka, Institutt for laboratoriemedisin, avdeling for patologi, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Sverige. E-post: jaakko.patrakka@ki.se Mottatt 27. juli 2020; revidert 11. mai 2021; akseptert 20. mai 2021; publisert på nett 18. juni 2021

SØKEORD: glomerulærendotelcelle; NF-kB; podocytt; Rarres1

Inflammatoriske veier aktiveres hos de flesteglomerulære sykdommermen molekylære mekanismer som driver dem i nyrevev er dårlig kjent. Vi identifiserteretinsyrereseptor responder 1 (Rarres1) som et sterkt podocytt-anriket protein i friske nyrer. Studier på podocyttspesifikke knockout-dyr indikerte at Rarres1 ikke var nødvendig for normal utvikling eller vedlikehold av glomerulus-filtrasjonsbarrieren og ikke modulerte utfallet av nyresykdom i en modell av glomerulonefritt. Interessant nok oppdaget vi en induksjon av Rarres1-ekspresjon i glomerulære og peritubulære kapillære endotelceller i IgA og diabetisk nyresykdom, så vel som i ANCA-assosiert vaskulitt. Analyse av offentlig tilgjengelige RNA-datasett viste at induksjon av Rarres1-ekspresjon var en vanlig molekylær mekanisme ved kroniske nyresykdommer. En betinget knock-in muselinje, som overuttrykker Rarres1 spesifikt i endotelceller, viste ingen åpenbar nyrefenotype. Imidlertid fremmet overekspresjonen progresjonen av nyreskade i en modell av glomerulonefritt. I tråd med dette ble betingede knock-out-mus, som mangler Rarres1 i endotelceller, delvis beskyttet i sykdomsmodellen. Mekanistisk fremmet Rarres1 betennelse og fifibrose via transkripsjonsfaktor Nuclear Factor-kB signalvei ved å aktivere reseptor tyrosinkinase Axl. Dermed er induksjon av Rarres1-ekspresjon i endotelceller en utbredt molekylær mekanisme i humane glomerulopatier, og dette ser ut til å ha en patogen rolle i å drive betennelse og fifibrose via Nuclear Factor-kB-signalveien.

Oversettelseserklæring

Vi identifiserte oppreguleringen avretinsyrereceptor responder protein 1 (Rarres1) i endotelceller (ECs) av vanlige humane glomerulopatier. Induksjonen ser ut til å ha en patogen rolle iglomerulær sykdomettersom progresjonen av glomerulonefritt ble (i) forverret i en mus som overuttrykker Rarres1 spesifikt i ECs, og (ii) forbedret i en EC-spesifikk Rarres1 knockout-linje. Rarres1 kan være en biomarkør for å oppdage mikrovaskulær skade ved nyresykdommer og potensielt et nytt terapeutisk mål.

Glomerulær sykdomprosesser er en viktig årsak til nyresykdom i sluttstadiet. Diabetisk nefropati (DN) er globalt den vanligste årsaken til nyresykdom i sluttstadiet, mens IgA-nefropati (IgAN) er den mest utbredte primære glomerulonefritt (GN).1,2 Histologisk manifesterer glomerulær skade i disse vanlige lidelsene seg i en svært lik mote. Dette inkluderer aktivering av glomerulære endotelceller (GEC), utvidelse av ekstracellulær matrise, spredning av mesangiale celler, podocyttskade og til slutt tap av podocytter.3

Globale transkripsjonsprofileringsstudier i humane nyrebiopsier har vist en sterk inflammatorisk signatur ved glomerulære lidelser, 4–7 og musestudier har vist at aktiveringen av nukleær faktor-kB (NF-kB) og transformerende vekstfaktor-b (TGF-b) signalveier har viktige roller i sykdomsprogresjon.8,9 Viktigere er at farmasøytisk målretting av NF-kB-veien har renobeskyttende effekter i dyremodeller, noe som indikerer at veien er et potensielt mål å behandleglomerulære sykdommer.10,11 I podocytter har vi nylig identifisert G-proteinkoblet reseptor klasse C gruppe 5 medlem B som en modulator av NF-kB-mediert inflammatorisk respons.12 Imidlertid er aktiveringen av inflammatoriske veier i glomerulopatier sannsynligvis drevet av flere celletyper . Faktisk er aktiveringen av NF-kB-signalveien oppdaget i GECs i mange humane nyresykdommer.13,14 De molekylære mekanismene involvert i NF-kB-aktivering i GECs er dårlig forstått.

Retinoic Acid Receptor Responder1 kan fremme utvikling avGlomerulære sykdommer

I denne studien analyserte vi molekylære signaturer til menneskerglomerulære sykdommerog identifiserte induksjonen avretinsyrereseptor responder 1 (Rarres1) uttrykk i GECs som en vanlig molekylær signatur i DN, IgAN og anti-nøytrofilt cytoplasmatisk autoantistoff (ANCA) -assosiert vaskulitt. Studier i muselinjer med aktivering/inaktivering av Rarres1-ekspresjon i endotelceller (ECs) viser at denne induksjonen har en patogen rolle i en musemodell av GN. Mekanistisk aktiverer Rarres1 reseptortyrosinkinase Axl, noe som fører til aktivering av NF-kB-signalveien. Vi foreslår Rarres1 som en ny biomarkør for mikrovaskulær skade som kan være et attraktivt terapeutisk mål forglomerulær sykdomprosesser ved å modulere inflammatoriske responser.

Figur 1|(Fortsatt) (c) BackSPIN-analyse som viser Rarres1-ekspresjon spesifikt i podocytter (PD) i RNAseq-data fra murint nyrevev (data fra Woroniecka et al.6). (d) Relative mRNA-nivåer av Rarres1 i isolert Tub og Glom fra humane prøver. Data er uttrykt som en fold endring av Rarres1-uttrykk i Glom sammenlignet med Tub. *P < 0.05="" versus="" badekar.="" (e)="" representativt="" konfokalt="" fl-fluorescerende="" mikroskopisk="" bilde="" av="" rarres1-uttrykk="" (grønt)="" av="" podocytter="" i="" human="" glomeruli="" fra="" normale="" forsøkspersoner.="" (f)="" representative="" konfokale="" mikroskopiske="" bilder="" som="" viser="" uttrykket="" av="" rarres1="" i="" podocytter="" fra="" mennesker;="" vimentin="" ble="" brukt="" som="" en="" markør="" for="" store="" prosesser="" og="" nefrin="" som="" en="" markør="" for="" fotprosesser="" av="" podocytter.="" cd31="" ble="" brukt="" som="" en="" markør="" for="" endotelceller,="" og="" ⍺-glattmuskelaktin="" (⍺sma)="" ble="" brukt="" som="" en="" mesangial="" cellemarkør.="" stolper="50/10" mm.="" data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" studentens="" t-test="" ble="" brukt="" for="" sammenligninger="" mellom="" 2="" grupper.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

METODER

RNA-ekstraksjon og sanntids polymerasekjedereaksjon

Glomeruli ble isolert som beskrevet tidligere.15 RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol-reagens (Invitrogen) og RNeasy Kit (Qiagen Inc.). iScript cDNA Synthesis Kit ble brukt til å generere cDNA. Den kvantitative polymerasekjedereaksjonen ble utført ved bruk av CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System med SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Primere som brukes er oppført i tilleggstabell S1. De relative uttrykksnivåene ble beregnet ved å bruke 2-DDCT-metoden.

Cellekultur

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – plasmid (VectorBuilder Inc. Kloner har ekspandert under puromycin (Merck KGaA) seleksjon. Transfeksjon av kort interfererende RNA (siRNA) for Axl/Rarres1 ble utført ved bruk av siRNA fra Origene. Celler ble transfektert med nM 30 siRNA etterfulgt av kompleksering med JetPEI transfeksjonsreagens (Polyplus-transfeksjon SA) med eller uten TGF-b1 stimuli (10 ng/ml i kulturmedium) Axl-inhibitoren R428 (Selleck Chemicals) ble tilsatt 1 time før behandling (3 mmol/ l).

Hvorfor Retinoic Acid Receptor Responder1 kan fremme utvikling avGlomerulære sykdommer?

Western blot

Celler ble lysert med RIPA-lysebuffer supplert med protease/fosfataseinhiberingscocktailer (Roche). Proteiner fra kjernefysiske fraksjoner ble isolert ved bruk av Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe). Lysater ble separert på 4 prosent –12 prosent Tris-glycin natrium dodecyl sulfate-polyakrylamid gel (Invitrogen) og overført til polyvinyliden difluorid membraner (Bio-Rad). Membranene ble blokkert med 5 prosent bovint serumalbumin (Merck). Inkubasjon med primære antistoffer ble utført over natten (antistoffer i tilleggstabell S2). Pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer og Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) ble brukt til å oppdage signaler. Western blot-analyser ble utført minst to ganger.

RNA in situ hybridisering

RNAscope-analysene ble utført i parafininnstøpte humane nyrer i henhold til produsentens protokoll (ACD). Probene som ble brukt var NPHS1 - Kat. nr. 416071-C2, PECAM1 - Kat. nr. 487381-C3, og RARRES1 - tilpassede probe målrettet mot nukleotider {{8 }}.

Vurdering av nyreskade

Urinalbumin og kreatininforhold ble evaluert ved å bruke Mouse Albumin ELISA Kit (Allbuwell M; Ethos Biosciences) og QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems). Nyrevev ble fiksert i 10 prosent nøytral bufret formalinløsning og innebygd i parafin, etterfulgt av kutting og periodisk syre-Schiff-farging. Elektronmikroskopi ble utført i prøver fiksert i 2,5 prosent glutaraldehyd.

Immunfarging

Parafininnstøpt vev ble fiksert i 24 timer i formalin. Fem mikrometerseksjoner ble avparafinisert og mikrobølgeovnbehandlet enten i tris-etylendiamintetraeddiksyrebuffer (10 mM Tris-base, 1 mM etylendiamintetraeddiksyrebufferløsning, 0.05 prosent Tween 20, pH 9.0) eller natriumsitratbuffer (10 mM natriumcitrat, 0,05 prosent Tween 20, pH 6,0), etterfulgt av permeabilisering med 0,3 prosent Triton X-100 og blokkert med 10 prosent normalt geiteserum, 3 prosent hydrogenperoksidase og Vector Blocking Kit (Vector Laboratories). Objektglass ble utviklet ved bruk av DAB-peroksidase (pepperrotperoksidase) substratsett, 3,30 -diaminobenzidin (Vector Laboratories).

For frosne seksjoner ble acetonfikserte seksjoner permeabilisert med 0,1 prosent Tween 20 og blokkert med 10 prosent normalt geiteserum. Primære antistoffer som brukes er oppført i tilleggstabell S1. Alexa-Fluor sekundære antistoffer for immunfluorescens ble oppnådd fra Molecular Probes (Life Technologies). Bilder ble tatt med Leica SP8 Confocal Microscope (Leica Microsystems).

Menneskeprøver

Nyrebiopsier ble hentet fra Karolinska Universitetssykehuset (Stockholm, Sverige). Kontrollprøver ble tatt fra de friske nyrepolene til individer som gjennomgikk tumornefrektomi. Den lokale etiske komiteen godkjente studien (godkjenning nr. 2010/579-31/1, Stockholm, Sverige).

kontra kontroll (Ctrl.) eller ***P < {{0}}.001="" versus="" si-negativ="" kontroll="" (scramble)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (c)="" representative="" western="" blot-dokumenter="" og="" oppsummerte="" data="" som="" viser="" de="" relative="" proteinnivåene="" til="" pp65="" i="" isolerte="" nukleære="" fraksjoner="" av="" podocytter="" behandlet="" med="" 1="" 0="" ng/ml="" tgf-b1.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" versus="" kontrollpodocytter="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" representative="" western="" blot-dokumenter="" og="" oppsummerte="" data="" som="" viser="" de="" relative="" proteinnivåene="" til="" pp65="" i="" isolerte="" nukleære="" fraksjoner="" av="" podocytter="" behandlet="" med="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428,="" n="2." (e)="" representativ="" western="" blot="" som="" viser="" at="" overekspresjon="" av="" rarres1="" aktiverer="" axl="" konstitutivt.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (f)="" relative="" mrna-nivåer="" av="" emt-relaterte="" gener="" i="" podocytter="" som="" overuttrykker="" rarres1="" (rarres1)="" eller="" kontrollpodocytter="" (ctrl.)="" transfektert="" med="" sirna="" for="" axl="" (siaxl),="" si-negativ="" kontroll="" (scramble),="" ##p="">< 0,01,="" ##="" #p="">< 0,001="" versus="" scramble,="" n="3," eller="" behandlet="" med="" 3="" mmol/l="" r428.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" versus="" ctrl.,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" versus="" rarres1,="" *p="">< 0,05="" versus="" rarres1,="" n="4." data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sd.="" students="" t-test="" ble="" brukt="" for="" sammenligninger="" mellom="" 2="" grupper.="" ut,="">

Figur 3|Etablering av podocyttspesifikke Rarres1 knockout (CreD/Rarres1flfl/flfl) mus. (a) Generering av betingede knockout-mus der Rarres1 er spesifikt ablated i podocytter ved å bruke Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet. Exon 3 slettes på NPHS2-Kremediert rekombinasjon. (b) Genotyping ble bekreftet ved halepreparering og polymerasekjedereaksjon ved 4 ukers alder. (Fortsettelse)

Figur 3|(Fortsatt) (c) Representativ Western blot som viser det reduserte uttrykket av Rarres1 i isolerte glomeruli fra podocyttspesifikke Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) mus. (d) Podocyttspesifikt tap av Rarres1 påvirker ikke albuminurinivåer hos mus behandlet med nefrotoksisk serum (NTS) som analysert ved urinalbumin-til-kreatinin-forhold i forskjellige grupper av mus (NTS-ctrl., n {{1{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Mikrofotografier og kvantifiseringer som viser typiske glomerulære strukturendringer i forskjellige grupper av mus. Glomerulære lesjoner ble identifisert i periodiske syre-Schiff-fargede seksjoner. #P < 0.0001="" versus="" ubehandlet="" kontroll="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" representative="" mikrofotografier="" og="" kvantifiseringer="" av="" gjennomsnittlig="" glomerulær="" basalmembran="" (gbm)="" tykkelse="" og="" antall="" spalter="" per="" mm="" gbm="" i="" forskjellige="" grupper="" av="" mus="" ved="" transmisjonselektronmikroskopianalyser.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" versus="" ubehandlet="" kontroll="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" enveis="" variansanalyse="" etterfulgt="" av="" tukeys="" posttest="" for="" flere="" sammenligninger="" ble="" brukt="" for="" grupper="" på="" 3="" eller="" flere.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

Muselinjer

Floksede Rarres1-mus med C57Bl/6J-bakgrunn (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) var podocin (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) og Tie2 cre-mus (B6.Cg-Tg( Tek-cre) 12Flv/J) for å generere cellespesifikke knockout-mus. GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J-musene ble krysset med en Tie2-cre-linje for å aktivere Rarres1-ekspresjon spesifikt i ECs.17 Avl og genotyping ble utført i henhold til standarden prosedyrer. Alle dyrestudier ble utført i preklinisk laboratorium (Karolinska Institutet) i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter og godkjent av den etiske komiteen for forskning på dyrepleie (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Nefrotoksisk serum (NTS) -indusert nefropati hos mus

Sju til 9-uker gamle mus fikk 50 ml Complete Freund's Adjuvant (Merck) sc, etterfulgt av NTS-injeksjon (iv; 6 ml/kg kroppsvekt; Probetex Inc.) på dag 4.18 Urin ble samlet 3, 7 , 10 og 14 dager etter injeksjonen, og mus ble drept på dag 14.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført ved bruk av Prism 9.0 programvare (GraphPad).

Dataene ble først undersøkt for normalitet (Shapiro-Wilk test). Når fordelingen var Gaussisk, ble dataene analysert ved hjelp av en parametrisk test (Students t-test for 2 grupper, og variansanalyse med Tukeys post-test for mer enn 2 grupper). Når fordelingen ikke var gaussisk, ble ikke-parametriske tester (Friedman-test med Dunns post-test for mer enn 2 grupper og Mann-Whitney U-test for 2 grupper) brukt. Forskjellene ble ansett som signifikante når P <>

RESULTATER

Rarres1 uttrykkes av podocytter

Vi vurderte først uttrykksmønsteret til Rarres1 i murint og humant nyrevev. Polymerasekjedereaksjonsanalyser viste at Rarres1 uttrykkes signifikant høyere i den glomerulære enn i den tubulointerstitielle fraksjonen av musenyrebarken (Figur 1a og b6). Encellet RNA-sekvenseringsanalyse av murint nyrevev avslørte at Rarres1 utelukkende uttrykkes av podocytter (figur 1c). Hos mennesker ble Rarres1 også beriket i glomerulært vev (figur 1d). I immunfluorescens av normalt humant nyrevev, viste Rarres1 et høyt signal i glomeruli (Figur 1e). Doble farginger viste at Rarres1 var lokalisert "utenfor" nefrinreaktivitet i kapillærløkkene, noe som tyder på podocyttekspresjon (figur 1f). Kolokalisering med vimentin indikerte lokalisering til store prosesser. Ingen overlappende reaktivitet ble sett for EC-markør CD31 eller mesangial markør -glattmuskelaktin (Figur 1f).

Rarres1 fremmer NF-kB og TGF-b1 signalering via reseptor tyrosinkinase Axl

For å belyse rollen til Rarres1 i podocytter, manipulerte vi ekspresjonsnivåene i immortaliserte humane podocytter.16 Rarres1-nivåer ble betydelig oppregulert i podocytter stabilt transfektert med humant Rarres1 cDNA og nedregulert etter transfeksjon med Rarres1-målretting av siRNA (Figure 2a). Overekspresjon av Rarres1 oppregulerte uttrykket av epitel-mesenkymale overgangsrelaterte gener, mens nedreguleringen av den endogene Rarres1 hadde motsatt effekt (figur 2b). Siden NF-kB-signalering har en viktig rolle i den epiteliale-mesenkymale overgangen som fører til fifibrose og betennelse i GN,19 målte vi TGF-b1-indusert NF-kB-signalaktivering in vitro. Rarres1-overuttrykk forårsaket økt aktivering av NF-kB-banen ved baseline og etter TGF-b1-stimulering (figur 2c). Ettersom Rarres1 har blitt rapportert å aktivere reseptor tyrosinkinase Axl, og på den måten fremme NF-kB signalveien ved inflammatorisk brystkreft,20 vurderte vi om Axl er en potensiell funksjonell partner av Rarres1 i nyrevev. TGF-b1-indusert NF-kB-aktivering kan hemmes av R428, en selektiv småmolekylær hemmer av Axl-kinase21,22 (Figur 2d), og overuttrykket av Rarres1 korrelerte positivt med den konstitutive aktiveringen av Axl-kinase (Figur 2e). Uttømmingen av Axl-aktivitet med R428, men ikke gendemping av Axl av siRNA, kan redusere den Rarres1-induserte ekspresjonen av epitel-mesenkymale overgangsrelaterte gener, som vist ved reduserte mRNA-nivåer (Figur 2f). Merk at ingen aktivering av ikke-kanoniske NF-kB-veier ble oppdaget (tilleggsfigur S1). Dermed fremmet Rarres1 NF-kB-signalering i dyrkede podocytter via aktivering av Axl-kinase.

Hvorfor Retinoic Acid Receptor Responder1 kan fremme utvikling av glomerulære sykdommer?

Inaktivering av Rarres1 i podocytter fører ikke til glomerulære abnormiteter eller modulerer utfallet av nefropati i en anti-glomerulær basalmembran (GBM) GN-modell

For å analysere rollen til Rarres1 i podocytter in vivo, genererte vi en ny Rarres1flfl/flfl (floxed) muselinje og krysset den med podocin-Cre-mus for å produsere Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl-mus (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) (Figur 3a) ). Genotyper for floxed/Cre-alleler ble identifisert ved øregenotyping (figur 3b). Polymerasekjedereaksjonsanalyse av tubulointerstitielle og glomerulære fraksjoner, så vel som av levervev, bekreftet delesjonen av ekson 3 spesifikt i glomerulus (tilleggsfigur S2A), og Rarres1 proteinnivåer ble redusert i glomeruli fra Creþ/Rarres1flfl/flfl mus (figur 3c).

Figur 4|Oppregulering av Rarres1 i glomerulære og peritubulære kapillære endotelceller hos pasienter med kronisk nyresykdom. (a) Analyser av Rarres1, collagen1a2 (COL1A2) og nephrin (NPHS1) genekspresjon i mikroarraydata av glomeruli isolert fra pasienter med diabetisk nefropati (DN), vaskulitt, IgA nefropati (IgAN) og kontroll (Ctrl.) personer. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" versus="" kontrollemner.="" (b)="" kvantitativ="" polymerasekjedereaksjonsanalyse="" for="" rarres1-,="" col1a2-="" og="" nphs1-gener="" i="" isolerte="" glomeruli="" fra="" pasienter="" med="" dn="" (n="5)" og="" kontroller="" (n="5)." **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" versus="" kontrollpersoner.="" (c)="" analyser="" av="" rarres1-="" og="" col1a2-genuttrykk="" i="" mikroarray-data="" av="" tubulær="" fraksjon="" isolert="" fra="" dn,="" vaskulitt,="" igan="" og="" kontrollpasienter.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" versus="" kontrollpersoner.="" (d)="" representative="" mikrofotografier="" av="" rarres1="" immunhistokjemisk="" farging="" i="" humant="" nyrekortikalt="" vev="" fra="" kontroller="" og="" pasienter="" med="" dn="" (n="5)," anti-nøytrofilt="" cytoplasmatisk="" autoantistoff="" (anca)="" vaskulitt="" (n="4)" og="" igan="" (="" n="5)." pilene="" indikerer="" rarres1-positive="" podocytter="" (kontroll)="" og="" endotelceller="" (ecs)="" (dn,="" igan="" og="" vaskulitt).="">

Figur 4|(Fortsatt) (e) Representative konfokale mikroskopiske bilder som viser uttrykket av Rarres1 i glomeruli hos pasienter med DN. CD31 ble brukt som en markør for EC. Stolper=50/10 mm. (f) Representative konfokale FL-fluorescerende bilder av RNAscope som viser Rarres1-genuttrykk i PECAM1--samuttrykkende celler i den tubulære fraksjonen av pasienter med DN. Data er uttrykt som gjennomsnitt ±SEM. Studentens t-test ble brukt for sammenligninger mellom 2 grupper. Stolper=50/10 mm. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.kidney-international.org.

Creþ/Rarres1flfl/flfl mus ble født med et forventet mendelsk arveforhold og de var levedyktige og fruktbare (data ikke vist). Nyrer kunne ikke skilles fra kontrollsøppel (Cre-/Rarres1flfl/flfl) som analysert ved rutinemessig lys- og elektronmikroskopisk undersøkelse (tilleggsfigur S2B og C). Dessuten var fordelingen av podocyttproteiner nefrin og synaptopodin upåvirket i Creþ/ Rarres1flfl/flfl mus (tilleggsfigur S2D)

For å belyse rollen til Rarres1 ved nyreskade in vivo, ble Creþ/Rarres1flfl/flfl behandlet med NTS som fører til IgG-avleiringer i GBM, albuminuri og progressive GN.23 Albuminurinivåer var like i både Creþ/Rarres1flfl/flfl og kontroll. mus (Figur 3d). Lysmikroskopisk undersøkelse avdekket ingen signifikante forskjeller i andelen affiserte glomeruli (Figur 3e). Elektronmikroskopi viste ingen forskjell i tykkelsen på GBM- eller fotprosessens utsletting, og GEC-er så ut til å være like påvirket i begge grupper (figur 3f). Podocyttmarkører nefrin, Wt1 og synaptopodin ble påvirket på lignende måte i begge grupper (tilleggsfigur S3A). Farging for EC-er ved bruk av CD31 viste heller ingen forskjeller i glomeruli eller peritubulære kapillærer mellom gruppene (tilleggsfigur S3B og C). I tillegg var uttrykket av fifibrose og betennelsesrelaterte gener tilsvarende forhøyet i begge gruppene behandlet med NTS (tilleggsfigur S4).

Rarres1-ekspresjon induseres i glomerulære og peritubulære kapillære ECs ved kronisk nyresykdom (CKD)

For å utforske rollen til Rarres1 i CKD, analyserte vi uttrykket i offentlig tilgjengelige RNA-datasett. Vi observerte signifikant forhøyede Rarres1-nivåer i glomeruli isolert fra pasienter med DN, ANCA-assosiert vaskulitt og IgAN (Figur 4a),4,6,24–26, mens andre podocyttassosierte gener, for eksempel nefrin, var signifikant nedregulert eller uendret . Vår kvantitative polymerasekjedereaksjonsanalyse av glomeruli isolert fra pasienter med DN (n=5) validerte induksjonen av Rarres1-uttrykk (figur 4b). På grunn av tap av podocytter, er uttrykket av podocyttgener vanligvis redusert i progressivglomerulære sykdommer,6 og forholdet mellom glomerulær Rarres1 og nefrinekspresjon ble økt med omtrent 20- ganger i DN versus friske glomeruli (figur 4b). Uttrykket av Rarres1 ble også oppregulert i tubulointerstitielle vevsdatasett i DN, ANCA-assosiert vaskulitt og IgAN (figur 4c).8–11

Deretter analyserte vi Rarres1-ekspresjon immunhistokjemisk i nyrebiopsier fra pasienter med DN (n ¼ 5), IgAN (n ¼ 5) og ANCA-assosiert vaskulitt (n ¼ 4). I syke glomeruli så Rarres1-farging ut til å være lokalisert til GEC-er som vist ved immunreaktivitet på den indre overflaten av kapillærveggene (Figur 4d, innfellinger), mens signalet fra podocytter virket svakere. I tubulointerstitielt rom ble fargingen oppdaget i peritubulære kapillærer (figur 4d, innfelt), noe som tyder på EC-uttrykk. Dobbel immunmerking med CD31 validerte lokaliseringen til EC i både glomeruli og peritubulære kapillærer (figur 4e). Tilsvarende viste doble RNAscope-eksperimenter kolokalisering av Rarres1 mRNA med PECAM1 mRNA i DN (figur 4f). Til sammen var induksjonen av Rarres1-uttrykk i glomerulære og peritubulære kapillære EC-er et vanlig fenomen ved CKD.

Generering og karakterisering av en muselinje som overuttrykker Rarres1 i ECs

Ettersom Rarres1 induseres i human CKD, genererte vi en ny transgen muselinje der Rarres1 cDNA ble introdusert i Rosa26-lokuset under CAG-promotoren,27 med en lox-STOP-lox-kassett mellom spleiseakseptorstedene (figur 5a). Linjen ble krysset med en Tie2-cre-linje for å generere Rarres1_Tie2_KI-mus, og mus ble identifisert ved øregenotyping for knockin- og Cre-alleler (Figur 5a). Rarres1_Tie2_KI-mus viste signifikant økte nivåer av Rarres1-protein i nyrevev (figur 5b), og den vellykkede knockin-strategien ble ytterligere validert ved analyse av Rarres1-mRNA-uttrykk i FACS-sortert GFP-positiv GEC-er (Figur 5c).

Vi fenotypede nyrene til Rarres1_Tie2_KI-mus og kontrollmus i alderstilpassede grupper. Ved lysmikroskopisk undersøkelse var nyremorfologien umulig å skille i Rarres1_Tie2_KI-mus fra kontrollkullkamerater (figur 5d). På samme måte viste elektronmikroskopi en uendret GBM-tykkelse og podocyttfotprosessbredde (figur 5e). Dessuten virket uttrykket av podocyttmarkører nefrin og synaptopodin upåvirket i Rarres1 som overuttrykker glomeruli (figur 5f). Merk at andre hovedorganer ikke viste makroskopisk eller mikroskopisk noen åpenbare abnormiteter (data ikke vist).

Figur 5|Etablering av endotelcellespesifikke Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) mus. (a) En generasjon av betingede knockin-mus der Rarres1-ekspresjon er spesifikt indusert i endotelceller (ECs) ved å bruke Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet. Tie2-Cre-mus ble krysset med mus som uttrykker målvektoren (Rarres1_casetteþ), som inneholdt en lox-STOP-lox-kassett mellom skjøten (fortsatt)

Figur 5|(fortsatt) akseptorsteder og Rarres1 cDNA under CAG-promotoren, som ble introdusert i Rosa26-lokuset, ble identifisert ved øregenotyping. Genotyping ble bekreftet ved ørepreparering og polymerasekjedereaksjon (PCR) ved 4 ukers alder. (b) Representativ Western blot som viser det økte uttrykket av Rarres1 i nyrebarken fra EC-spesifikke Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) mus. **P < 0.01="" versus="" kontroll="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" test).="" (c)="" kvantitativ="" pcr="" for="" rarres1="" i="" isolerte="" ec-er.="" **p="">< 0,01="" versus="" kontroll="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," elevens="" t-test).="" (d)="" representative="" mikrofotografier="" av="" periodic="" acid-schiff-fargede="" seksjoner="" som="" viser="" typiske="" glomerulære="" strukturer="" i="" forskjellige="" grupper="" av="" mus.="" (e)="" representative="" mikrofotografier="" og="" kvantifiseringer="" av="" gjennomsnittlig="" glomerulær="" basalmembran="" (gbm)="" tykkelse,="" og="" antall="" spalter="" per="" mm="" gbm="" i="" forskjellige="" grupper="" av="" mus="" ved="" transmisjonselektronmikroskopianalyser="" (students="" t-test).="" (f)="" representative="" konfokale="" mikroskopiske="" bilder="" som="" viser="" uttrykket="" av="" den="" podocyttspesifikke="" markøren="" synaptopodin="" og="" nefrin="" i="" ec-spesifikke="" rarres1="" knock-in="" mus="" (rarre1_tie2_ki)="" og="" ctrl.="" mus.="" stolper="10" mm.="" data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

Induksjon av Rarres1 i EC-er modulerer NF-kB-signalveien og utfallet av nefropati ved å regulere Axl-aktivering

For å evaluere om Rarres1-uttrykk i EC-er modulerer sykdomsprogresjon, induserte vi GN i transgene mus og deres kullkamerater med en enkelt injeksjon av NTS. Rarres1_- Tie2_KI-mus utviklet signifikant høyere albuminurinivåer enn kontrollene etter 3 dager, mens ingen signifikant forskjell i albuminuri ble sett etter 7, 10 og 14 dager (figur 6a). Histologisk analyse 14 dager etter induksjonen viste at Rarres1_Tie2_KI-mus ikke hadde flere glomerulære endringer, slik som sklerotiske lesjoner og halvmåner (Figur 6b). Elektronmikroskopisk evaluering viste imidlertid en betydelig tykkere GBM og mer fotprosessutsletting i Rarres1_Tie2_KI-mus (figur 6c). Videre viste Rarres1_Tie2_KI-mus økte nivåer av glattmuskelaktin i nyrebarken (Figur 6d). Analysen av podocyttmarkører nefrin, synaptopodin og WT1 viste en dyp reduksjon som antydet dedifferensiering og et betydelig tap av podocytter (figur 6d). Viktigere, Rarres1_Tie2_KI glomeruli viste færre WT1-positive podocytter sammenlignet med kontrolldyr, noe som indikerer at EC-uttrykt Rarres1 fremmet podocyttskade. Det ble også påvist flere fibrintrombi i Rarres1_Tie2_KI glomeruli (Figur 6e). I tråd med dette ble uttrykket av ulike gener relatert til betennelse, fifibrose og tubulær nyreskade betydelig oppregulert i Rarres1_- Tie2_KI-mus som vist ved sanntids polymerasekjedereaksjonsanalyse for Il -1beta-, Col1a1-, TGF-b1- og nyreskademolekyl-128 i nyrebarkvev (figur 6f). Det ble imidlertid ikke påvist forskjeller i blod urea nitrogen og S-kreatinin verdier mellom gruppene (Figur 6g). Farging for EC-er ved bruk av CD31 viste heller ingen forskjeller i glomeruli eller peritubulære kapillærer mellom gruppene (tilleggsfigur S5A og B). Til sammen forverret EC-spesifikk induksjon av Rarres1-ekspresjon glomerulær patologi i NTS-indusert nefropati.

Mekanistisk analyserte vi om Rarres1-overuttrykk i EC-er fremmet aktiveringen av Axl- og NF-kB-signalering in vivo, i likhet med våre in vitro-observasjoner (figur 2). Både Rarres1_Tie2_KI og kontrollmus behandlet med NTS viste en aktivering av Axl-signalveien som vist ved økt Axl-fosforylering (figur 6h). Imidlertid var denne aktiveringen mer signifikant i Rarres1_- Tie2_KI-mus (figur 6h). Tilsvarende ble aktivering av NF-kB-vei fremmet i disse musene som vist ved antall pP65-positive kjerner i glomeruli (Figur 6i). Når pP65-nivåer ble målt ved Western blotting, oppdaget vi en lignende trend for NF-kB-veiaktivering, selv om dette ikke var signifikant, muligens på grunn av en uteligger (tilleggsfigur S5C).

Inaktivering av Rarres1 i ECs reduserer glomerulær skade i anti-GBM glomerulonephritis-modellen

For å validere den patogene rollen til EC-avledet Rarres1 i CKD, genererte vi en muselinje der Rarres1 ble slettet i ECs ved å bruke Tie2-Cre (Figur 7a). Genotyper for floxed og Cre-alleler ble identifisert ved øregenotyping (figur 7b). Det var en trend for oppregulering av Rarres1 i NTS-behandlede mus, som ble opphevet i Rarres1_Tie2_KO-mus (figur 7c). Musene viste ingen åpenbare nyreabnormiteter (data ikke vist). Injeksjonen av NTS induserte lignende albuminuri i Rarres1_Tie2_KO og kontroller (Figur 7d). Histologisk analyse 14 dager etter induksjonen viste imidlertid færre glomerulære endringer i Rarres1_- Tie2_KO-mus (figur 7e). I elektronmikroskopi viste Rarres1_Tie2_KO-mus mindre utsletting av fotprosessen og fortykkelse av GBM (Figur 7f). Immunfarging viste ingen signifikante forskjeller for aSMA, nefrin eller synaptopodin (figur 7g). Imidlertid var antallet WT1-positive podocytter signifikant høyere i Rarres1_Tie2_KO-mus (figur 7g). Farging for pP65 viste et redusert antall positive kjerner i Rarres1_Tie2_KO glomeruli, noe som tyder på involvering av NF-kB-signalveien (figur 7h).

Figur 6|(fortsatt) kvantifisering av gjennomsnittlig glomerulær basalmembran (GBM) tykkelse og antall spalter per mm GBM i forskjellige grupper av mus ved transmisjonselektronmikroskopi-analyseseksjoner (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=12). (d) Representative konfokale mikroskopiske bilder som viser uttrykkene til nefrin, synaptopodin, ⍺-glattmuskelaktin (⍺Sma) og WT1 i nyrene fra forskjellige grupper av mus. Stolper {{10}}/10 mm. Det ⍺Sma-positive området ble telt per kortikalt tverrsnitt, og WT1 ble telt per glomerulus (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Uavgjort2_KI, n {{20}}). (e) Tilstedeværelse av fibrintrombi i glomeruli som påvist ved trikomfarging (talt per glomerulært tverrsnitt) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Uavgjort2_KI, n=5). (f) Relative mRNA-nivåer av forskjellig betennelse, fifibrose og renal tubulær skade-relaterte gener i nyrebarken til NTS-behandlede mus (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=6–10). (g) Serumkreatinin og blod urea nitrogen (BUN) nivåer i NTS-ctrl. (n=3) og NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) mus. (h) Representative Western blot-dokumenter og oppsummerte data som viser de relative proteinnivåene av Paxil i nyrebarken i forskjellige grupper av NTS-behandlede mus (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Uavgjort2_KI, n=5). (i) Representative mikrofotografier av pP65 immunhistokjemisk farging i nyrekortikalt vev fra forskjellige grupper av NTS-behandlede mus. pP65-positive kjerner per glomeruli ble kvantifisert i de forskjellige gruppene av mus (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EC-spesifikke Rarres1 knock-in mus (Rarres1_Tie2_KI mus); mus med Rarres1-kassett og uten Cre-uttrykk (Ctrl.) ble brukt som kontroll. #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" versus="" ubehandlet="" kontroll="" (ctrl.),="" *p="">< 0.05="" versus="" nts-behandlet="" kontroll="" (nts-ctrl.).="" data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" studentens="" t-test="" ble="" brukt="" for="" sammenligninger="" mellom="" 2="" grupper.="" enveis="" variansanalyse="" etterfulgt="" av="" tukeys="" posttest="" for="" flere="" sammenligninger="" ble="" brukt="" for="" grupper="" på="" 3="" eller="" flere.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

DISKUSJON

Rarres1 ble først identifisert i hudflåtekulturer behandlet med tazaroten29 og har vist seg å fungere som en invasjonsrepressor i prostatakreftcellelinjer.30 Ved inflammatorisk brystkreft regulerer Rarres1 in vitro invasjonen av kreftceller gjennom mediering av Axl-signalveien . I detalj stabiliserer Rarres1 Axl ved å hemme den proteasomavhengige nedbrytningen av Axl. Videre nedregulerer uttømmingen av Rarres1 i SUM149-celler Axl-ekspresjon og inaktiverer NF-kB, noe som fører til redusert invasjon av inflammatoriske brystkreftceller.20 I tillegg induseres Rarres1-ekspresjon hos pasienter med avansert fifibrose, og en profibrotisk rolle til Rarres1 har blitt indusert. foreslått i en rottelungefifibrosemodell og under fibrogen aktivering av hepatiske stellatceller.31 Samlet antyder tidligere in vitro-studier en rolle for Rarres1 i fifibrose, betennelse og kreftinvasjon.

Opprinnelig vakte Rarres1 interessen vår da den var sterkt beriket i podocyttceller. Vi kunne vise at Rarres1 fremmet inflammatorisk og profibrotisk signalering i podocytter via Axl-mediert NF-kB-veiaktivering. På den annen side klarte ikke podocyttspesifikke knockout-dyr å vise noen åpenbar forskjell sammenlignet med kontroller under sunne forhold så vel som i en musemodell av GN. Dette kan skyldes kompenserende mekanismer ettersom NF-kB-signalveien er regulert av en rekke molekyler og biologiske prosesser.

Molekylær profilering av pasienter med diabetes indikerte at Rarres1 ble indusert i glomerulære og peritubulære kapillære ECs i DN. Viktigere, Rarres1-ekspresjon ble ikke oppdaget i ECs hos diabetespasienter uten nefropati. Derfor spekulerer vi i at Rarres1 kan være en ny markør for diabetisk mikrovaskulær sykdom, og studier i plasma- og urinprøver er indisert for å utforske muligheten for Rarres1 som en ikke-invasiv biomarkør. Vi identifiserte induksjonen av Rarres1 også hos pasienter med IgAN og vaskulitt. Det er fristende å spekulere i at Rarres1 har en patogen rolle i disse glomerulopatiene og bidrar til sykdomsprogresjon. Funksjonelt viste vi at induksjonen av Rarres1 i ECs økte nyreskaden i en murin modell av GN, mens inaktiveringen av Rarres1 i ECs forbedret skaden. Fenotypisk analyse viste at podocytter ble påvirket i mus som overuttrykker Rarres1 i ECs. Dette kan være en direkte effekt av Rarres1 på podocytter ettersom en løselig form av Rarres har blitt beskrevet.32 Alternativt kan podocyttskade være sekundær til skaden av glomerulus filtrasjonsbarrieren.

Tidligere har endotelial NF-kB-aktivering vist seg å spille en patogen rolle i utviklingen av nyresykdom ved vaskulitt.13 Spesielt opphevet hemming av den endoteliale NF-kB-banen i en modell av halvmåne-GN progresjonen. Axl-hemmere har vist seg å være gunstige ved eksperimentell anti-GBM-nefritt. Mus behandlet med den mest selektive småmolekylære hemmeren, R428, viste betydelig bevaring av nyrefunksjonen og redusert inflammatorisk cytokinproduksjon.33 Dette indikerer at veien kan være et terapeutisk alternativ forglomerulær sykdomprosesser. Men siden både Axl og NF-kB modulerer en rekke forskjellige cellulære prosesser i hele kroppen, er det usannsynlig at det er en god kandidat for farmasøytisk målretting ved CKD. Rarres1 kan gi et mer nyreassosiert mål.

Tie2-Cre har vist seg å drive uttrykk i en underpopulasjon av hematopoietiske celler.34 Noen av disse cellene kan modulere den inflammatoriske responsen i den NTS-induserte modellen, og derfor kan vi ikke utelukke at hematopoietiske celle-avledet Rarres1 bidrar til sykdomsprogresjon i Tie2-Cre-linjer. Men siden vi ikke oppdaget noe åpenbart Rarres1-uttrykk i infiltrerende immunceller, tror vi at dette er mindre sannsynlig.

Mens dette manuskriptet var under utarbeidelse, rapporterte Chen et al.32 en løselig form av Rarres1 som fremmerglomerulær sykdomprogresjon. De identifiserte, på samme måte som oss, oppreguleringen av Rarres1 i vanlige humane glomerulære sykdommer. Studien støtter vårt funn om at økt Rarres1-uttrykk korrelerer med nedsatt nyrefunksjon ihuman glomerulær sykdom. I motsetning til resultatene våre konkluderte de imidlertid med at oppreguleringen av Rarres1 skyldtes overekspresjon i podocytter. Vi kan ikke utelukke den muligheten, men vi oppdaget i menneskelige sykdommer en distinkt induksjon av Rarres1-uttrykk i ECs. En mekanisme som forklarer funnene våre kan være at den løselige formen av Rarres1 produsert av podocytter tas opp av GEC-er. Resultatene om at vi oppdaget Rarres1 mRNA i ECs ved in situ hybridisering og at Rarres1 også ble indusert i peritubulære kapillære ECs støtter sterkt ideen om at uttrykket av Rarres1 i nyresykdommer hovedsakelig er av endotel opprinnelse.

Figur 7|Endotelspesifikk ablasjon av Rarres1 demper nyreskade hos nefrotoksisk serum (NTS)-behandlede mus. (a) Generering av betingede knockout-mus der Rarres1 er spesifikt ablated i endotelceller ved bruk av Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet. Exon 3 slettes på Tie2-Cre-mediert rekombinasjon. (b) Genotyping ble bekreftet ved halepreparering og polymerasekjedereaksjon ved (fortsatt)

Figur 7|(fortsettelse) 4 ukers alder. (c) Representative Western blot-dokumenter og oppsummerte data som viser de relative proteinnivåene til Rarres1 i nyrebarken i forskjellige grupper av NTS-behandlede mus (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Tie2_KO, n=4) og ubehandlede mus (Kontroll [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (urin="" albumin-til-kreatinin="" ratio)="" i="" forskjellige="" grupper="" av="" mus="" på="" nts-behandling="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" mikrofotografier="" og="" kvantifiseringer="" som="" viser="" typiske="" glomerulære="" strukturendringer="" i="" forskjellige="" grupper="" av="" mus.="" glomerulære="" lesjoner="" ble="" identifisert="" i="" periodiske="" syre-schiff-fargede="" seksjoner="" (ctrl.,="" n="3;" nts-behandlet="" kontroll="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" representative="" mikrofotografier="" og="" kvantifiseringer="" av="" gjennomsnittlig="" glomerulær="" basalmembran="" (gbm)="" tykkelse="" og="" antall="" spalter="" per="" mm="" gbm="" i="" forskjellige="" grupper="" av="" mus="" ved="" transmisjonselektronmikroskopi-analyseseksjoner="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_uavgjort2_ko,="" n="16)." (g)="" representative="" konfokale="" mikroskopiske="" bilder="" som="" viser="" uttrykkene="" til="" nefrin,="" synaptopodin,="" glattmuskelaktin="" (sma)="" og="" wt1="" i="" nyrene="" fra="" forskjellige="" grupper="" av="" mus.="" stolper="50/10" mm.="" det="" sma-positive="" området="" ble="" talt="" per="" kortikalt="" tverrsnitt="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" representative="" mikrofotografier="" av="" pp65="" immunhistokjemisk="" farging="" i="" nyrekortikalt="" vev="" fra="" forskjellige="" grupper="" av="" nts-behandlede="" mus.="" pp65-positive="" kjerner="" per="" glomeruli="" ble="" kvantifisert="" i="" de="" forskjellige="" gruppene="" av="" mus="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" versus="" ubehandlet="" ctrl.,="" *p="">< 0,05="" versus="" nts-ctrl.="" data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" studentens="" t-test="" ble="" brukt="" for="" sammenligninger="" mellom="" 2="" grupper.="" enveis="" variansanalyse="" etterfulgt="" av="" tukeys="" posttest="" for="" flere="" sammenligninger="" ble="" brukt="" for="" grupper="" på="" 3="" eller="" flere.="" for="" å="" optimalisere="" visningen="" av="" dette="" bildet,="" se="" nettversjonen="" av="" denne="" artikkelen="" på="">

Det er noen få begrensninger i denne studien som bør erkjennes. For det første er det utført in vitro-studier i podocytter, mens vi in ​​vivo manipulerte uttrykket i ECs. Derfor kan vi ikke direkte koble Rarres1 til Axl-aktivering i EC-er. For det andre, mens vi kunne identifisere en Rarres1--indusert (Axl-avhengig) aktivering av NF-kB-signalering i podocytter, undersøkte vi ikke den molekylære mekanismen bak denne prosessen. Flere studier er nødvendig for å utforske det tidligere funnet om at Rarres1 fremmer Axl-aktivering ved å hemme dens proteasomavhengige nedbrytning. Til slutt utfordret vi våre knockout/-in-dyr bare med den NTS-induserte nefropatimodellen. Derfor er flere studier i dyremodellene indisert for å se om Rarres1 har en patogen rolle også i andre sykdomsprosesser.

For å oppsummere, viser vår studie at i vanlige humane glomerulopatier induseres det podocytt-anrikede proteinet Rarres1 i ECs, noe som fører til betennelse, podocyttskade og fifibrose. Dette er potensielt mediert ved å forbedre NF-kB-signalveien via aktivering av reseptortyrosinkinase Axl (figur 7). Rarres1 er en ny biomarkør for mikrovaskulær skade og kan potensielt være et nytt terapeutisk mål for å undertrykke betennelse og fifibrose ved CKD

FORMIDLING

ML er ansatt i AstraZeneca, Gøteborg, Sverige. JPs forskning er støttet av AstraZeneca. Alle de andre forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

TAKK

Denne studien ble støttet av KM-H fra Diabetes Wellness Sverige og til JP fra KI/AZ Integrated Metabolic Center, Marianne och Marcus Wallenberg Foundation, Swedish Diabetes Foundation, Swedish Kidney Foundation og Center for Innovative Medicine.

FORFATTERBIDRAG

KM-H, ML og JP designet forskningen; KM-H, DD, EC, SZ og GG utførte forskningen; KM-H og XL analyserte dataene; AW ga menneskelige prøver; og KM-H og JP skrev oppgaven.

Hvorfor Retinoic Acid Receptor Responder1 kan fremme utvikling av glomerulære sykdommer?

TILLEGGSMATERIALE

Tilleggsfil (PDF)

Tabell S1. Primerpar av målgener ble brukt for sanntids RT-PCR i denne studien.

Tabell S2. Antistoffer ble brukt i denne studien. Tilleggsfil (PowerPoint)

Figur S1. Rarres1-overuttrykk aktiverer ikke den ikke-kanoniske NF-kB-signalveien. Representativt Western blot-dokument og oppsummerte data som viser at overekspresjon av Rarres1 ikke aktiverer p100/p52 i podocytter behandlet med 10 ng/ml TGF-b1 (n=2). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Studentens t-test ble brukt for sammenligninger mellom to grupper. UT, ubehandlet.

Figur S2. Etablering av podocyttspesifikke Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) mus. (A) Konvensjonell PCR-analyse i tubulære og glomerulære fraksjoner, så vel som i levervev. (B) Histologisk undersøkelse (PAS-farging) av nyrepatologi hos Cre– /Rarres1flfl/flfl og Creþ/Rarres1flfl/flfl mus. (C) Representative transmisjonselektronmikrografer (TEM) og kvantifisering av gjennomsnittlig glomerulær basalmembran (GBM) tykkelse og antall spalter per mm GBM i forskjellige grupper av mus (n=3). (D) Representative konfokale mikroskopiske bilder som viser uttrykket av podocyttspesifikke markører, synaptopodin og nefrin, i podocyttspesifikke Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) og kontrollmus (Cre-/Rarres1flfl/flfl). Bar=10 mm.

Figur S3. Ekspresjonsnivåene av podocyttmarkører og CD31 i nyrene til NTS-behandlede mus. (A) Representative konfokale mikroskopiske bilder som viser uttrykket av nefrin, WT -1 og synaptopodin i podocytter fra NTS-behandlede Rarres1 podocyttspesifikke knockout-mus (Creþ/Rarres1flfl/flfl) og kontrollkullkamerater (Cre-/Rarres1flfl) flfl ). Bar=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Andel CD31-positive kapillærer i peritubulære områder. Tretti peritubulære områder ble evaluert per mus. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Elevens t-test. (C) Semikvantitativ skåring av CD31-signalet i glomeruli: 0=intet signal, 1=svakt signal, 2=moderat signal, 3=sterkt signal. Ti glomeruli evaluert fra hver mus (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Elevens t-test.

Figur S4. Ekspresjonsnivåene for markører for fifibrose, betennelse og tubulær skade i nyrene til NTS-behandlede mus. (A) Representative konfokale mikroskopiske bilder som viser uttrykkene for -Sma i nyrene fra NTS-behandlede Rarres1 podocyttspesifikke knockout-mus (Creþ/Rarres1flfl/flfl) og kontrollkullkamerater (Cre-/Rarres1flfl/flfl). Bar=100 mm. (B) Relative mRNA-nivåer av forskjellige betennelses-, fifibrose- og renale tubulære skaderelaterte gener i nyrebarken til NTS-behandlede mus. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" versus="" kontroll="" (ctrl.);="" data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" elevens="" t-test="" ble="" brukt="" for="" sammenligninger="" mellom="" 2="" grupper="" (sham="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3">

Figur S5. Uttrykket av C31 og aktivert P65 i NTS-behandlede nyrer. (A) Andelen CD31-positive kapillærer i peritubulære områder. Tretti peritubulære områder ble evaluert per mus (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Elevens t-test. (B) Semikvantitativ skåring av CD31-signalet i glomeruli: 0=intet signal, 1=svakt signal, 2=moderat signal, 3 =sterkt signal. Ti glomeruli ble evaluert fra hver mus (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Elevens t-test. (C) Representative Western blot-dokumenter og oppsummerte data som viser de relative proteinnivåene av pP65 i nyrebarken i forskjellige grupper av NTS-behandlede mus og ubehandlede kontroller (ctrl.) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=10). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Studentens t-test ble brukt for sammenligninger mellom 2 grupper.

REFERANSER

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Molecular mechanisms of diabetic nyresykdom. J Clin Invest. 2014;124:2333–2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F, et al. IgA nefropati. Nat Rev Dis Primere. 2016;2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Forstå podocyttbiologi for å utvikle nye nyreterapi. Endokrinol foran (Lausanne). 2018;9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F, et al. Definere celletypespesifisitet på transkripsjonsnivå ved menneskelig sykdom. Genome Res. 2013;23:1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S, et al. Vevstranskriptomdrevet identifikasjon av epidermal vekstfaktor som en biomarkør for kronisk nyresykdom. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T, et al. Transkriptomanalyse av human diabetisk nyresykdom. Diabetes. 2011;60:2354–2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K, et al. NFkappaB fremmer betennelse, koagulasjon og fifibrose i den aldrende glomerulus. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587–597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R, et al. NFkappaB-indusert periostin aktiverer integrin-beta3-signalering for å fremme nyreskade i GN. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475–1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transformerende vekstfaktor-beta1 og diabetisk nefropati. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB, et al. Aktivering av kjernefaktor-kappa B av podocytter i den autologe fasen av passiv Heymann-nefritt. Nyre Int. 2001;59:923–931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R, et al. Transcription factor decoy for NFkappaB hemmer cytokin- og adhesjonsmolekyluttrykk i synovialceller avledet fra revmatoid artritt. Revmatologi (Oxford). 2000;39:749–757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X, et al. GPRC5b modulerer inflammatorisk respons iglomerulære sykdommervia NF-kappaB-veien. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573–1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C, et al. Endotelial NF-kappaB blokade opphever ANCA-indusert GN. J Am Soc Nephrol. 2017;28:3191– 3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. In situ glomerulær ekspresjon av aktivert NF-kappaB i human lupus nefritis og en annen ikke-proliferativ proteinurisk glomerulopati. Virchows Arch. 2006;448:172–183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J, et al. Storskala identifikasjon av gener involvert i nyre glomerulus utvikling og funksjon. EMBO J. 2006;25:1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J, et al. En betinget udødeliggjort human podocyttcellelinje som viser nefrin- og podocinekspresjon. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630–638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Lavt blodtrykk hos endotelcellespesifikke endotelin 1 knockout-mus. Hypertensjon. 2010;56:121–128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Anti-glomerulær basalmembransykdom. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162–1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX, et al. FK506 reduserer albuminuri gjennom å forbedre podocyttnefrin og podocinekspresjon hos diabetiske rotter. Inflflamm Res. 2016;65:103–114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T, et al. TIG1 fremmer utvikling og progresjon av inflammatorisk brystkreft gjennom aktivering av Axl kinase. Cancer Res. 2013;73:6516–6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. R428, en selektiv småmolekylær hemmer av Axl-kinase, blokkerer tumorspredning og forlenger overlevelse i modeller av metastatisk brystkreft. Cancer Res. 2010;70:1544–1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. AXL-hemmere i kreft: et medisinsk kjemiperspektiv. J Med Chem. 2016;59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Eksperimentell membranøs glomerulonefritt hos rotter. Kvantitative studier av glomerulær immunavleiring i isolerte glomeruli og hele dyr. J Clin Invest. 1980;66:71-81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. Transkripsjonell nettverksanalyse på tvers av arter definerer delte inflammatoriske responser i murin og human lupus nefritt. J Immunol. 2012;189:988–1001.

25. Grayson P, Eddy S, Taroni J, et al. Metabolske veier og immunmetabolisme ved sjeldne nyresykdommer. Ann Rheum Dis. 2018;77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V, et al. Transkriptomisk og proteomisk profilering gir innsikt i mesangial cellefunksjon ved IgA nefropati. J Am Soc Nephrol. 2017;28:2961–2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Effektiv seleksjon for høyekspresjonstransfektanter med en ny eukaryot vektor. Gene. 1991;108:193–199.

28. Loefflfler I, Wolf G. Epitel-til-mesenkymal overgang i diabetisk nefropati: fakta eller fiksjon? Celler. 2015;4:631–652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano A, et al. Tazaroten-indusert gen 1 (TIG1), en romanretinsyrereseptor-responsivt gen i huden. J Invest Dermatol. 1996;106:269-274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C, et al. Tazaroten-indusert gen 1 (TIG1) uttrykk i prostatakarsinomer og dets forhold til tumorigenisitet. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482–490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN, et al. Identifikasjon av RARRES1 som en kjerneregulator i leverfifibrose. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439–1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H, et al. Løselig RARRES1 induserer podocytt-apoptose for å fremmeglomerulær sykdomprogresjon. J Clin Invest. 2020;130:5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Målrettet hemming av Axl-reseptortyrosinkinase forbedrer anti-GBM-indusert lupuslignende nefritt. J Autoimmun. 2018;93:37–44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X, et al. Bidraget fra Tie2þ-avstamningen til primitive og definitive hematopoietiske celler. Genesis. 2010;48:563–567