3.2. Effekt av mediatorkonsentrasjon på melaninavfarging av LMS

I følge relevante studier,cistancheer en vanlig urt som er kjent som "mirakelurten som forlenger livet". Dens hovedkomponent er cistanosid, som har ulike effekter som f.eksantioksidant, anti-inflammatorisk, ogfremme av immunfunksjonen. Mekanismen mellom cistanche ogbleking av hudenligger i antioksidanteffekten til cistanche glykosider. Melanin i menneskelig hud produseres ved oksidasjon av tyrosin katalysert av tyrosinase, og oksidasjonsreaksjonen krever deltakelse av oksygen, så oksygenfrie radikaler i kroppen blir en viktig faktor som påvirker melaninproduksjonen. Cistanche inneholdercistanoside, som er en antioksidant og kan redusere dannelsen av frie radikaler i kroppen, dermedhemmer melaninproduksjonen.

Klikk på Hvor kan jeg kjøpe Cistanche

For mer info:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Effekten av mediatorkonsentrasjonen på avfargingsutbyttet ved LMS ble undersøkt (figur 3). LMS ved bruk av lacT og 100 µM acetosyringon viste det høyeste avfargingsutbyttet, som var 4.4- ganger høyere enn uten mediatoren. LMS ved bruk av lacM og 100 µM acetosyringon viste det høyeste avfargingsutbyttet, som var 6.7- ganger høyere enn uten mediatoren. Når lacT ble brukt for LMS, økte avfargingsutbyttet ved bruk av acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon med økende konsentrasjon og nådde deretter et maksimum ved konsentrasjoner på henholdsvis 100, 50 og 200 µM (Figur 3a). Acetosyringon og syringaldehyd forbedret avfargingsutbyttet mer effektivt ved en lavere konsentrasjon enn acetovanillon. Når blonder ble brukt til LMS, var effekten av mediatorkonsentrasjon veldig lik resultatet oppnådd med lacT. Avfargingsutbyttet ved bruk av acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon nådde et maksimum ved konsentrasjoner på henholdsvis 100, 50 og 200 µM (figur 3b). En mediatorkonsentrasjon på over 200 µM reduserte avfargingsutbyttet signifikant (data ikke vist). Derfor ble en mediator på 100 uM valgt som den optimale konsentrasjonen for følgende eksperimenter. Lloret et al. rapporterte at den optimale mediatorkonsentrasjonen bør brukes fordi laccase kan inaktiveres av en høy konsentrasjon av mediator [6], mens Khammuang og Sarnthima rapporterte at melaninavfargingsaktiviteten til LMS ved bruk av vanillin og vanillinsyre ikke var signifikant påvirket av høye konsentrasjoner av opp til 10 mM [28]. Den optimale mediatorkonsentrasjonen kan være avhengig av mediatortypen og målforbindelsen til den lakkase-katalyserte reaksjonen [5,6]. Når LMS katalyserte nedbrytningen av isoproturon, økte nedbrytningsutbyttet med økende konsentrasjoner av acetosyringon, mens konsentrasjonene av vanillin og syringaldehyd ikke var relatert til nedbrytningsutbyttet [7].

3.3. Cytotoksisitet av naturlige mediatorer

For å bruke naturlige mediatorer som hudblekende kosmetiske ingredienser, ble cytotoksisiteten til mediatorer (acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon) undersøkt ved å bruke B16F10 melanomcellelinjen. De naturlige mediatorene ble behandlet på de dyrkede cellene og cellelevedyktigheten ble målt ved NR-analysen. Når mediatorer på over 22 mM ble tilsatt til de dyrkede cellene, reduserte de cellelevedyktigheten betraktelig (figur 4). Når konsentrasjonen av mediatoren var høyere enn 5 mM, økte cellelevedyktigheten i følgende rekkefølge: acetosyringon > syringaldehyd > acetovanillon. Videre viste mediatorer på mindre enn 1 mM ingen hemmende effekt på B16F10 melanomceller. Disse resultatene indikerer at den optimale mediatorkonsentrasjonen på 0,1 mM brukt i dette arbeidet viste ubetydelig cytotoksisitet.

3.4. Effekten av pH på melaninavfarging av LMS

Figur 5 viser effekten av pH på LMS-avfargingsutbyttet. Mangelen på en mediator viste det høyeste avfargingsutbyttet ved pH 4, og avfargingsutbyttet avtok med økende pH (Figur 5a). Denne profilen ligner på effekten av pH på lakkase-katalysert ABTS-oksidasjon [37]. Generelt har lacT optimal aktivitet ved sure forhold på mindre enn pH 5, og aktiviteten avtar med en økning i pH. Ved høyere pH kombineres hydroksydanionene med T2/T3-kobberet av lacT og forstyrrer elektronoverføringen og forårsaker en reduksjon i katalytisk aktivitet. Effekten av pH på LMS er imidlertid mer komplisert og kan påvirkes av aktiviteten og stabiliteten til laccase og oksiderte mediatorer [1,7]. Avfargingsutbyttet av lacT med acetosyringon økte med økende pH opp til 7 (41 prosent). Det optimale avfargingsutbyttet av lacT med syringaldehyd og acetovanillon var henholdsvis 32 prosent og 42 prosent ved pH 6. Selv om mangel viste lavere katalytisk aktivitet ved høyere pH, økte melaninavfarging med økende pH. Disse resultatene kan forklares av den høye aktiviteten og stabiliteten til de oksiderte formene av naturlige mediatorer ved høy pH.

lacM uten mediator viste det høyeste avfargingsutbyttet ved pH 6, og lacM viste et lavere avfargingsutbytte i alle pH-områder sammenlignet med sist. Den optimale pH-verdien til blonder var omtrent 6 for oksidasjon av ABTS [38]. Derfor var den optimale pH-verdien til lacM uten mediator lik den til lacM for ABTS-oksidasjon. Når de naturlige mediatorene ble brukt med lacM, var avfargingsutbyttet svært avhengig av reaksjonens pH (Figur 5b). Avfargingsutbyttet av lacM med naturlige mediatorer økte med økende pH opp til pH 7. Maksimal avfargingsutbytte for lacM med acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon var henholdsvis 40 prosent, 32 prosent og 33 prosent ved pH 7. Det høye melanin avfargingsaktivitet ved nøytral pH gjør bruken av LMS med naturlige mediatorer bedre for huden fordi det optimale pH-området er likt det for normal hud (rundt 5,5).

3.5. Kinetisk studie av melaninavfarging av LMS

En kinetisk studie av melaninavfarging av LMS med acetosyringon ble undersøkt kvantitativt for å forstå den forsterkende effekten av naturlige mediatorer (tabell 1). Km-verdien til lacT uten mediator var 10,6- ganger høyere enn for lacT med acetosyringon. Dette betyr at affiniteten for melanin ble sterkt forbedret ved bruk av en mediator. Cat-verdien av lacT med mediator var 22.6- ganger høyere enn for lacT uten mediator. Dette indikerer at avfargingshastigheten ble betydelig økt av mediatoren. Spesifisitetskonstanten (kcat/Km) til lacT ble forbedret 247 ganger ved å bruke acetosyringon som mediator. Disse resultatene viser tydelig at den begrensede tilgangen til melanin til det aktive stedet for laccase ble overvunnet av acetosyringon. Km-verdien til lacM uten mediator var 2.4- ganger høyere enn for lacM med acetosyringon. Affiniteten til melanin kan forsterkes ved å bruke en mediator. Imidlertid var den økende effekten for melaninaffinitet av lacM med acetosyringon lavere enn for lacT med acetosyringon. Katteverdien til blonder var omtrent 26 prosent av den siste. Blondene uten mediator viste svært lav aktivitet for melaninavfarging. Imidlertid var cat-verdien til lacM med mediatoren 161- ganger høyere enn for lacM uten mediator. Avfargingshastigheten med lacM ble betydelig økt av mediatoren. Derfor ble spesifisitetskonstanten til blonder 334 ganger forsterket ved bruk av acetosyringon som mediator. Disse resultatene demonstrerer nytten av acetosyringon som en mediator av laccaser for melaninavfarging.

3.6. Avfarging av melanin/cellulosefilmen av LMS

En melanin/cellulose-kompositt-hydrogelfilm ble fremstilt for å etterligne melanin i huden. Melanin/cellulosehydrogelfilmen kan fremstilles ved samtidig oppløsning av melanin og cellulose i [Emim][Ac], som etterfølges av regenerering med vann. Den oppnådde filmen viste en transparent mørkebrun farge. Avfargingen av melanin/cellulosehydrogelfilmen ble utført med lacM med acetosyringon i 0.1 M sitronsyrefosfatbuffer (pH 5,5). Fargen på melanin/cellulosefilmen endret seg fra mørkebrun til blekbrun etter den LMS-katalyserte reaksjonen (figur 6a). Når absorbansen til melanin/cellulosefilmen ble målt etter avfargingsreaksjonen i området 400–700 nm, sank absorbansen til melanin/cellulosefilmen betydelig over hele bølgelengdeområdet (Figur 6b). Avfargingen av melanin ble også bekreftet gjennom måling av fargeverdier (L*, a* og b*) av melanin/cellulosefilmen ved bruk av et kolorimeter. ∆L-, ∆E-, YI- og WI-verdiene ble beregnet fra fargeparametrene (tabell 2). Etter melanin-avfargingsreaksjonen med LMS ble L*-verdien (lyshet) av melanin/cellulosefilmen betydelig økt, mens a*-verdiene (rødhet) og b* (gulhet) reduserte noe. ∆E-verdien som representerer fargeforskjellen mellom prøvene var 31,1. En ∆E-verdi større enn 12 indikerte at fargene på filmen før og etter reaksjonen er ganske forskjellige fra hverandre [31]. Gulheten (YI) av filmen avtok fra 209 til 92 etter avfargingsreaksjonen, mens hvitheten (WI) økte fra 16 til 43. Łopusiewicz et al. rapporterte at YI av poly(melkesyre)/melaninfilm økte med økende melanininnhold, mens WI av filmen sank [32]. Derfor forklarer endringene i fargeegenskapene kvantitativt avfargingen av melanin i melanin/cellulosehydrogelfilmen. Disse resultatene viser at LMS effektivt kan avfarge melanin i et cellulosehydrogelmiljø.

3.7. Avfarging av naturlig melanin produsert av melanomceller

Naturlig melanin i menneskelig hud er delt inn i eumelanin (svart til brunt) og pheomelanin (gult til rødt), mens det syntetiske melaninet fremstilt ved oksidasjon av tyrosin med hydrogenperoksid er en analog av eumelanin. Derfor ble avfargingen av naturlig melanin produsert av melanomceller også undersøkt i dette arbeidet. Avfargingen av syntetisk melanin og naturlig melanin av LMS med blonder og acetosyringon ble sammenlignet ved å måle absorbansen i området 400–700 nm (Figur 7). Absorbansen av syntetisk melanin avtok raskt med økende reaksjonstid ved alle bølgelengder. Absorbansen til avfarget naturlig melanin viste imidlertid et annet mønster sammenlignet med det for avfarget syntetisk melanin. Absorbansen til avfarget naturlig melanin avtok ved bølgelengder større enn 450 nm, mens absorbansen økte ved bølgelengder mindre enn 450 nm. Flere studier er nødvendige for å forstå økningen i absorbansen av avfarget naturlig melanin.

4. Konklusjoner

I denne studien ble avfarging av melanin oppnådd ved å bruke "O2/laccase/mediator"-systemet, siden laccase viste lav katalytisk aktivitet for direkte oksidasjon av melanin på grunn av dets lave redokspotensial og begrensede tilgang av melanin til det aktive stedet for laccase. Syv typer naturlige mediatorer ble vellykket brukt for å erstatte syntetiske mediatorer (HOBt) for melaninavfarging av LMS ved bruk av lacT og blonder. Blant de testede naturlige mediatorene, viste acetosyringon og syringaldehyd, inneholdende to metoksygrupper, høye avfargingshastigheter og utbytter. Acetovanillon inneholdende en metoksygruppe og en ketongruppe viste også et høyt avfargingsutbytte i likevektstilstanden. LMS med naturlige mediatorer viste høy avfargingsaktivitet ved pH til normal hud, og cytotoksisiteten til naturlige mediatorer var svært lav. En kinetisk studie av LMS ved bruk av acetosyringon for melaninavfarging viste at acetosyringon effektivt overvant begrensningene til lacT og lacM ved å øke affiniteten for melanin og avfargingsaktivitet. LMS med acetosyringon avfarget melaninet som er tilstede i cellulosehydrogelfilmen, som etterligner huden. Videre kunne LMS med acetosyringon avfarge ikke bare syntetiske eumelaninanaloger fremstilt ved oksidasjon av tyrosin, men også naturlig melanin produsert av melanomceller. Dermed kan LMS som bruker naturlige mediatorer brukes som et effektivt hudblekende middel i kosmetikkindustrien.

Tilleggsmaterialer:Følgende er tilgjengelige online, Figur S1: Melaninavfargingen ved LMS ved bruk av laccase fra T. versicolor og M. thermophila, Figur S2: Starthastigheten for melaninavfargingsreaksjonen med laccase fra T. versicolor og M. thermophila.

Forfatterbidrag:Konseptualisering, SP, DJ og SHL; Datakurering, SHL; Formell analyse, SP; Finansieringsoppkjøp, SHL; Etterforskning, SP, DJ og HD; Metodikk, SP, DJ og HD; Prosjektadministrasjon, SHL; Ressurser, SHL; Programvare, JY, DL og SH; Tilsyn, SHL; Validering, JY, DL, SH og SHL; Visualisering, JY, DL og SH; Skriving – originalutkast, SP og DJ; Skriving – gjennomgang og redigering, SHL Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:Dette arbeidet ble støttet av Konkuk University i 2018.

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:Ikke aktuelt.

Erklæring om informert samtykke:Ikke aktuelt.

Datatilgjengelighetserklæring:Ikke aktuelt.

Interessekonflikter:Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Referanser

1. Sterk, PJ; Claus, H. Laccase: En gjennomgang av dens fortid og dens fremtid innen bioremediering. Crit. Rev. Environ. Sci. Teknol. 2011, 41, 373–434. [CrossRef]

2. Mayer, AM; Staples, RC Laccase: Nye funksjoner for et gammelt enzym. Phytochemistry 2002, 60, 551–565. [CrossRef]

3. Camarero, S.; Ibarra, D.; Martinez, MJ; Martínez, AT Lignin-avledede forbindelser som effektive Laccase-mediatorer for avfarging av forskjellige typer gjenstridige fargestoffer. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 1775–1784. [CrossRef] [PubMed]

4. Campos, R.; Cavaco-Paulo, A.; Kandelbauer, A.; Robra, KH; Gübitz, GM Indigo-nedbrytning med rensede laccaser fra Trametes hirsuta og Sclerotium rolfsii. J. Biotechnol. 2001, 89, 131–139. [CrossRef]

5. Ostadhadi-Dehkordi, S.; Tabatabaei-Sameni, M.; Forootanfar, H.; Kolahdouz, S.; Ghazi-Khansari, M.; Faramarzi, MA Nedbryting av noen benzodiazepiner av et lakkase-mediert system i vandig løsning. Bioressur. Teknol. 2012, 125, 344–347. [CrossRef]

6. Lloret, L.; Eibes, G.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Feijoo, G.; Lema, JM Laccase-katalysert nedbrytning av antiinflammatoriske midler og østrogener. Biochem. Eng. J. 2010, 51, 124–131. [CrossRef]

7. Zeng, S.; Qin, X.; Xia, L. Nedbrytning av ugressmiddelet isoproturon ved hjelp av laccase-mediator-systemer. Biochem. Eng. J. 2017, 119, 92–100. [CrossRef]

8. Ibarra, D.; Romero, J.; Martinez, MJ; Martínez, AT; Camarero, S. Utforsker de enzymatiske parameterne for optimal delignifisering av eukalyptmasse ved hjelp av laccase-mediator. Enzym mikrob. Teknol. 2006, 39, 1319–1327.

9. Fillat, A.; Colom, JF; Vidal, T. En ny tilnærming til biobleking av linmasse med laccase ved bruk av naturlige mediatorer. Bioressur. Teknol. 2010, 101, 4104–4110. [CrossRef] [PubMed]

10. Camarero, S.; Ibarra, D.; Martínez, AT; Romero, J.; Gutiérrez, A.; del Río, JC Delignifisering av papirmasse ved bruk av laccase og naturlige mediatorer. Enzym mikrob. Teknol. 2007, 40, 1264–1271. [CrossRef]

11. Zerva, A.; Simi´c, S.; Topakas, E.; Nikodinovic-Runic, J. Applications of Microbial Laccases: Patent Review of the Past Decade (2009–2019). Catalysts 2019, 9, 1023. [CrossRef]

12. Cañas, AI; Camarero, S. Laccases og deres naturlige formidlere: Bioteknologiske verktøy for bærekraftige miljøvennlige prosesser. Bioteknologi. Adv. 2010, 28, 694–705. [CrossRef] [PubMed]

13. Shleev, S.; Tkac, J.; Christenson, A.; Ruzgas, T.; Yaropolov, AI; Whittaker, JW; Gorton, L. Direkte elektronoverføring mellom kobberholdige proteiner og elektroder. Biosens. Bioelektron. 2005, 20, 2517–2554. [CrossRef] [PubMed]

14. Christopher, LP; Yao, B.; Ji, Y. Biologisk nedbrytning av lignin med laccase-mediatorsystemer. Front. Energi Res. 2014, 2, 1–13. [CrossRef]

15. Bourbonnais, R.; Paice, MG Oksidasjon av ikke-fenoliske substrater: En utvidet rolle for laktase i biologisk nedbrytning av lignin. FEBS Lett. 1990, 267, 99-102. [CrossRef]

16. Srebotnik, E.; Hammel, KE Nedbrytning av ikke-fenolisk lignin av laccase/1-hydroksybenzotriazol-systemet. J. Biotechnol. 2000, 81, 179–188. [CrossRef]

17. Baiocco, P.; Barreca, AM; Fabbrini, M.; Galli, C.; Gentili, P. Fremme av laccase-aktivitet mot ikke-fenoliske substrater: En mekanistisk undersøkelse med noen laccase-mediatorsystemer. Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 191–197. [CrossRef]

18. Fabbrini, M.; Galli, C.; Gentili, P. Sammenligning av den katalytiske effektiviteten til noen mediatorer av laccase. J. Mol. Catal. B-enzym. 2002, 16, 231–240. [CrossRef]

19. González, MD; Vidal, T.; Tzanov, T. Elektrokjemisk studie av fenoliske forbindelser som forsterkere i lakkase-katalyserte oksidative reaksjoner. Elektroanalyse 2009, 21, 2249–2257. [CrossRef]

20. Yang, L.; Guo, X.; Jin, Z.; Guo, W.; Duan, G.; Liu, X.; Li, Y. Fremveksten av melanin-inspirerte superkondensatorer. Nano Today 2021, 37, 101075. [CrossRef]

21. Caldas, M.; Santos, AC; Veiga, F.; Rebelo, R.; Reis, RL; Correlo, VM Melanin nanopartikler som et lovende verktøy for biomedisinske applikasjoner - En gjennomgang. Acta Biomater. 2020, 105, 26–43. [CrossRef]

22. Woo, SH; Cho, JS; Lee, BS; Kim, EK Avfarging av melanin med ligninperoksidase fra Phanerochaete chrysosporium. Bioteknologi. Bioprosess Eng. 2004, 9, 256–260. [CrossRef]

23. Kaneko, S.; Cheng, M.; Murai, H.; Takenaka, S.; Murakami, S.; Aoki, K. Purification and Characterization of an Extracellular Laccase from Phlebia radiata Strain BP-11-2 That Decolorizes Fungal Melanin. Biosci. Bioteknologi. Biochem. 2009, 73, 939–942. [CrossRef]

24. Mohorˇciˇc, M.; Friedrich, J.; Renimel, I.; André, P.; Mandin, D.; Chaumont, J.-P. Produksjon av melaninblekende enzym av soppopprinnelse og dets anvendelse i kosmetikk. Bioteknologi. Bioprosess Eng. 2007, 12, 200–206. [CrossRef]

25. Kim, BS; Blaghen, M.; Hong, H.; Lee, K. Rensing og karakterisering av et melanin biologisk nedbrytningsenzym fra Geotrichum sp. Int. J. Cosmetic Sci. 2016, 38, 622–626. [CrossRef] [PubMed]

26. Sung, HJ; Khan, MF; Kim, YH Rekombinant ligninperoksidase-katalysert avfarging av melanin ved bruk av in-situ generert H2O2 for bruk i blekekosmetikk. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 136, 20–26. [CrossRef]

27. Shin, SK; Hyeon, JE; Joo, Y.; Jeong, DW; Du, SK; Han, SO Effektiv melanin-nedbrytning av et synergistisk laccase-peroxidase-enzymkompleks for hudbleking og andre praktiske bruksområder. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 129, 181–186. [CrossRef]

28. Khammuang, S.; Sarnthima, R. Avfarging av syntetiske melaniner av rå laccases av Lentinus polycarpous Lév. Folia Microbiol. 2013, 58, 1–7. [CrossRef] [PubMed]

29. Repetto, G.; del Peso, A.; Zurita, J. Nøytral rød opptaksanalyse for estimering av cellelevedyktighet/cytotoksisitet. Nat. Protoc. 2008, 3, 1125–1131. [CrossRef] [PubMed]

30. Castellar, MR; Obón, JM; Fernández-López, JA Isolasjonen og egenskapene til en konsentrert rød-lilla betacyanin matfargestoff fra Opuntia stricta frukter. J. Sci. Food Agric. 2006, 86, 122–128. [CrossRef]

31. Cserhalmi, Z.; Sass-Kiss, Á.; Tóth-Markus, M.; Lechner, N. Studie av sitrusjuicer behandlet med pulserende elektrisk felt. Innov. Food Sci. Emerg. Teknol. 2006, 7, 49–54. [CrossRef]

32. Łopusiewicz, L.; J˛edra, F.; Mizieli ´ska, M. Nye poly(melkesyre) aktive emballasjekomposittfilmer inkorporert med soppmelanin. Polymers 2018, 10, 386. [CrossRef] [PubMed]

33. Pralea, IE; Moldovan, RC; Petrache, AM; Ilies, , M.; Heghes, , SC; Ielciu, I.; Nicoară, R.; Moldovan, M.; Ene, M.; Radu, M.; et al. Fra utvinning til avanserte analytiske metoder: Utfordringene ved melaninanalyse. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3943. [CrossRef] [PubMed]

34. Tran-Ly, AN; Reyes, C.; Schwarze, FWMR; Ribera, J. Mikrobiell produksjon av melanin og dets ulike anvendelser. World J. Microbiol. Bioteknologi. 2020, 36, 1–9. [CrossRef] [PubMed]

35. Medina, F.; Aguila, S.; Baratto, MC; Martorana, A.; Basosi, R.; Alderete, JB; Vazquez-Duhalt, R. Prediksjonsmodell basert på beslutningstreanalyse for lakkasemediatorer. Enzym mikrob. Teknol. 2013, 52, 68–76. [CrossRef]

36. Fillat, U.; Prieto, A.; Camarero, S.; Martínez, AT; Martínez, MJ Biodeinking av fleksografiske blekk med sopplakkaser ved bruk av syntetiske og naturlige mediatorer. Biochem. Eng. J. 2012, 67, 97–103. [CrossRef]

37. Hong, J.; Jung, D.; Park, S.; Å, Y.; Å, KK; Lee, SH Immobilisering av laccase via tverrbundne enzymaggregater fremstilt ved bruk av genipin som en naturlig tverrbinder. Int. J. Biol. Macromol. 2021, 169, 541–550. [CrossRef]

38. Berka, RM; Schneider, P.; Golightly, EJ; Brown, SH; Madden, M.; Brown, KM; Halkier, T.; Mondorf, K.; Xu, F. Karakterisering av genet som koder for en ekstracellulær laccase av Myceliophthora thermophila og analyse av det rekombinante enzymet uttrykt i Aspergillus oryzae. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 3151–3157. [CrossRef]

For mer informasjon: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501