LRRK2 kinasehemmer forynger oksidativt stress-indusert cellulær alderdom i nevronale celler del 1

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

Bakgrunn.Leucinrik gjentatt kinase 2 (LRRK2) spiller en kritisk rolle i patogenesen av Parkinsons sykdom (PD). Aldring er den mest kritiske risikofaktoren for progresjon av PD. Korrelasjonen mellom aldring og cellulær senescens er etablert. Cellulær senescens er korrelert med dysregulering av den proteolytiske banen og mitokondriell dysfunksjon, som også er assosiert med aggregering av -synuklein (-syn). Metoder. Humane dopaminerge nevronlignende celler (differensierte SH-SY5Y-celler) ble behandlet med rotenon i nærvær eller fravær av LRRK2-kinasehemmeren GSK2578215A(GSK-KI) i 48 timer. Markørene for cellulær senescens, inkludert p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galaktosidase(-gal), Rb-fosforylering, senescensassosiert (SA) -gal-aktivitet, oglysosomaltaktivitet, ble undersøkt. Dash-cellene og primære kortikale nevroner fra rotte ble behandlet med -syn-fibriller 30 minutter før behandling med rotenon i nærvær eller fravær av GSK-KI i 48 timer. Mus ble intraperitonealt injisert med rotenon og MLi-2 (LRRK2 kinasehemmer) en gang annenhver dag i to uker. Resultater. Rotenon oppregulerte LRRK2-fosforylering og -gal-nivåer gjennom aktivering av p53-p21-signalaksen og nedregulerte Rb-fosforylering. I tillegg oppregulerte rotenon SA -gal aktivitet, nivåer av reaktive oksygenarter og LRRK2fosforyleringog hemmet lysosomaktivitet. Rotenon-indusert LRRK2-oppregulering svekket clearance av a-syn-fibriller. Behandling med LRRK2-hemmer dempet rotenonindusert cellulær senescens og -syn-akkumulering. Konklusjoner. Rotenon-indusert oppregulering av LRRK2-kinaseaktivitet fremmet cellulær senescens, noe som forbedret -syn-akkumulering. Imidlertid forynget administrasjonen av en LRRK2-kinasehemmer rotenon-indusert cellulær senescens.

Klikk her for å vite mer

1. Introduksjon

Parkinsons sykdom (PD), som er den vanligste nevrodegenerative sykdommen, er preget av nedsatt motorisk kontroll[1]. Flere genetiske og miljømessige faktorer bidrar til patogenesen av PD[2-5].LRRK2, en viktig genetisk risikofaktor for PD, viser både GTPase- og kinaseaktiviteter [6]. LRRK2 G2019S-mutanten, som viser forbedret kinaseaktivitet, fremmer PD-progresjon [7]. Risikoen for å utvikle PD hos pasienter som huser G2019S-mutanten øker med alderen [8] ettersom aldring er assosiert med progresjon av nevrodegenerative sykdommer [9]. Tidligere hadde vi rapportert at LRRK2-kinaseaktivitet fremmet cellulær senescens og hemmet nedbrytningen av alfa-synuklein (-syn) aggregater [10]. -Syn er en hovedkomponent av Lewy-legemer (LB) eller Lewy-nevritt, som er postmortem-markørene for PD. Nedsatt nedbrytning av -syn resulterer i aggregering av den [11].

Cellulær senescens svekker proteinnedbrytningsmaskineriet[12-14]. Eksponering for lavdose rotenon, som er rapportert å indusere PD, fremmer cellulær senescens i den humane trabekulære meshwork-cellelinjen [15]. I tillegg oppregulerer rotenon LRRK2 kinaseaktivitet i nevronene [16]. Derfor antok vi at rotenon fremmer cellulær senescens gjennom aktivering av LRRK2-kinase og følgelig forbedrer -syn-aggregering.

Cistanche kan forbedre immuniteten

2. Metoder og materialer

2.1. Cellekultur og behandling.

Den humane neuroblastomcellelinjen (SH-SY5Y-celler) ble dyrket i et vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) supplert med 1{{ 48}} prosent føtalt bovint serum (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1 prosent penicillin/streptomycin (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific), og 1 prosent mykoplasma-fjerningsreagens (KOMA)) ved 37 grader i en 5 prosent CO, inkubator (Thermo Fisher Scientific). De differensierte SH-SY5Y-cellene (dSH-celler) ble oppnådd etter behandling med 10μM all-trans retinsyre （R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fremstilt i et vekstmedium annenhver gang dager i syv dager. På dag 7 etter behandling med retinoidsyre ble cellene behandlet samtidig med rotenon (1 uM) og GSK2572815A (GSK-KI; LRRK2 kinasehemmer; 1μM）forberedt i et vekstmedium i 48 timer. Dimetylsulfoksid (DMSO) ble brukt som bærer for rotenon og GSK-KI. -syn-fibrillene ble renset som beskrevet tidligere [10]. De rotenon- og GSK-KI-behandlede cellene ble behandlet med a-syn-fibriller (70nM). Rottene primære kortikale nevroner ble behandlet med rotenon (1μM), GSK-KI (l μM) og a-syn fibril (70nM) i 48 timer. Behandlingsforholdene for de primære kortikale nevronene fra rotte var identiske med de som ble brukt for dSH. Cellene ble vasket to ganger med iskald fosfatbufret saltvann (PBS) og lysert i 1x prøvebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 prosent natriumdodecylsulfat, 10 prosent glyserol, 1 prosent -merkaptoetanol og 0,02 prosent bromfenolblått).

2.2. Isolering og kultur av primære kortikale nevroner fra E16 rotteembryoer.

Gravide rotter ble avlivet med CO, gass. Livmoren ble dissekert, og fostrene fra embryonale sekker ble plassert i iskald HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Hodeskallen ble skrellet ved hjelp av tang, og cortex ble dissekert fra hele hjernen. Etter fjerning av hjernehinnene ble hjernebarkene inkubert med 0.25 prosent Trypsin-EDTA(25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) ved 37 grader C i 20min. vann bad. Deretter ble cortexene inkubert med 40 ug/mL DNase I (DN25, Sigma-Aldrich), vortexet forsiktig og inkubert i 5 minutter i et 37 graders vannbad. Det meste av supernatanten ble fjernet ved sug, og prøvene ble inkubert med en serumhemmer-inneholdende MEM (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,5 prosent DMEM, 5 prosent FBS, 2,5 mg/ml bovint serumalbumin (BSA; A7906, Sigma-Aldrich), og 2,5 mg/ml trypsinhemmer (T9253, Sigma-Aldrich). Seruminhibitoren ble fjernet, og cellepelleten ble resuspendert i 10 ganger volumet med vekstmediet. Sammensetningen av vekstmediet var som følger: nevrobasalt medium(21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific),2 prosent B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), og 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). De isolerte primære kortikale nevroncellene fra rotte (3×10 grader/brønn) ble sådd i en 12-brønnplate (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Sør-Korea) og dyrket i vekstmediet ved 37 grader i en 5 prosent CO, inkubator i 24 timer. Kulturmediet ble erstattet med vekstmedium supplert med 0,2 mg/ml 5-fluor-2'-deoksyuridin (F0503, Sigma-Aldrich) og 96 ug/ml uridin (U3750, Sigma-Aldrich) til hemme mitose. På dag 6 ble cellene behandlet med 1 uM rotenon, 1 uM GSK-KI og 70 nM -syn-fibriller i 48 timer og høstet med lx prøvebuffer.

2.3. Western Blot.

Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [17]. Følgende antistoffer ble brukt for western blotting: kanin anti-LRRK2 fosfo-S935 monoklonal (ab133450, Abcam, Cambridge, Storbritannia), kanin anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonal (ab203181, Abcam), mus anti-LRRK2 monoklon (LRRK2) N241A/34, Neu-roMab, UC Davis, CA, USA), mus anti-p53 monoklonal (for menneskelig p53:sc-126; for mus p53:sc-393031;Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), mus anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoklonal (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, USA), mus anti-Rb monoklonal (#9309S, Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA , USA), anti-fosfoRb(Ser807/811)(#9308S, CST),mus anti- -galaktosidase monoklonal (sc-377257,Santa Cruz Biotech-nology),mus anti-p62 monoklonal(ab56416 ,Abcam), mus anti- -aktin monoklonal(sc-47778; Santa Cruz Bio-teknologi),kanin anti-LC3B polyklonal(#2775S; CST), mus anti- -syn (klon 42)monoklonal(610786; BD Bio-sciences, San Jose, CA, USA),anti-fosfo-treonin-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology),anti-LaminB(SC-6216,Santa Cruz Biotech-nology), geitperoksidase-konjugert AffiniPure anti-mus IgG(H pluss L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Labo-ratories Inc., West Grove, PA, USA), og geitperoksidase-konjugertAffiniPure anti-kanin IgG(H pluss L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)antistoffer. Immunoreaktive signaler i nitrocellulosemembranen ble utviklet med Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA), og bildene ble tatt med et MicroChemi4.2-kamera (Shimadzu, Kyoto, Japan).

2.4. Proximity Ligation Assay (PLA) og immunfluorescens (IF).

PLA ble utført ved bruk av Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS antistoff (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) , og Anti-Rabbit Plus-antistoff (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), etter produsentens instruksjoner. SH-SY5Y-cellene sådd i 96-brønnsvarte plater (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Østerrike) ble differensiert, og de differensierte cellene ble behandlet med rotenon og GSK-KI på dag 7. Cellene ble skylt to ganger med iskald Dulbeccos PBS(DPBS), fiksert med 4 prosent paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur (RT), og skylt tre ganger med iskald DPBS. Deretter ble cellene permeabilisert ved å bruke 0,1 prosent Triton X-100 fremstilt i DPBS. Etter vask tre ganger med kald DPBS, ble cellene inkubert med en dråpe blokkeringsløsning ved 37C i 1 time. Den blokkerende løsningen ble fjernet, og cellene ble inkubert med antistoffer (50 μL) ved 37 grader i 3 timer. Antistoffblandingen besto av et antistofffortynningsmiddel fra settet (antistoffer brukt for PLA: muse anti-LRRK2 monoklonalt (1:20) antistoff og kanin anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonalt (1:20) antistoff; antistoff brukt for IF-analysen: kylling anti- -gal polyklonalt antistoff(1:400, ab9361, Abcam)). I IF-analysen ble antistoffet tilsatt gjennom hele prosessen frem til PLA-påføringstrinnet. Prøvene ble deretter vasket to ganger med 1x vaskebuffer A i 5 minutter. For å klargjøre probeløsningen ble Duolink⑧In Situ PLA· Probe Anti-Mouse Minus og Anti-Rabbit Plus blandet med antistofffortynningsmiddelet (1:5). For IF-analysen ble anti- -gal-antistoffet også tilsatt (1:400) til blandingen. Cellene ble inkubert med 50μL av probeløsningen ved 37C i 1 time. Deretter ble cellene vasket to ganger med lx vaskebuffer A i 5 minutter. For IF-analysen ble ligase(40:1) og anti- -gal antistoff(400:1) blandet i ligeringsbufferen. Cellene ble inkubert med ligeringsløsningen (50 μL) ved 37 grader i 30 minutter og vasket to ganger med lx vaskebuffer A i 5 minutter. For IF-analysen,polymerase(1:40) ble inkubert med Goat Anti-Chicken IgY H pluss L(Alexa Fluor② 594; ab150172)sekundært antistoff(1:500) i 100 minutter ved 37C. Cellene ble vasket to ganger med 1x vaskebuffer B i 10 minutter, etterfulgt av vasking med 0,01x vaskebuffer B i 1 min. For å farge kjernen ble cellene inkubert med Hoechst 33342(1:1000;62249, Thermo Fisher Scientific) fremstilt i DPBS ved RT i 10 minutter. Bildene av cellene i 96-brønnens sorte plater ble tatt med et konfokalt laserskanningsmikroskop (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Tyskland).

2.5.Immunutfelling.

Helcellelysatene til dSH-celler behandlet med rotenon (1 μM) og GSK-KI (1 uM) ble klargjort ved bruk av lyseringsløsning (PBS, 1 prosent Triton X-100, 1x proteasehemmercocktail og lx fosfatase inhibitor cocktail). Lysatene ble sentrifugert ved 4,000g og 4 grader i 5 minutter, og supernatanten ble inkubert med anti-p53-antistoffet (554293, BD Biosciences) og PierceProtein G Aga-rose (20398, Thermo Fisher Scientific) resuspendert i lyseringsløsningen i 12 timer. Kulene ble vasket to ganger med lyseringsløsningen, og kule-proteinkomplekset ble denaturert med lx prøvebuffer.

2.6. Kjernefysisk fraksjonering.

Kjernefraksjonen ble isolert ved bruk av NE-PERr Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (78833, Thermo Fisher Scientific), etter produsentens instruksjoner.

2.7. mRNA-forberedelse og kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR).

mRNA ble isolert fra rotenon/GSK-KI-behandlede dSH-celler ved å bruke RNeasy Plus Mini-settet (74134, QIAGEN, Hilden, Tyskland). Deretter ble mRNA revers transkribert til komplementært DNA (cDNA) ved bruk av TOPscript cDNA Synthesis Kit (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Korea). cDNA ble utsatt for qRT-PCR ved bruk av TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX(SYBR Grønn med lav ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics). Følgende primere ble brukt for qRT-PCR: human p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(fremover)) og 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(revers); human p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(fremover) og 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(revers).qRT-PCR ble utført på Mic qPCR cycler(MIC-4,BioMolecular Systems,Upper Coomera, Australia).

2.8. Måling av senescens-assosiert (SA) galaktosidase (-Gal) aktivitet, reaktive oksygenarter (ROS) og lysosomaktivitet.

Ved 30 minutter etterbehandling ble levende dSH-celler farget med 2μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japan), 5uM 2',7'-diklorfluoresceindiacetat (DCFDA;287810, Calbio-chem, San Diego, CA, USA）, 2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og 1 μM Hoechst 33342 for å undersøke henholdsvis SA -gal aktivitet, ROS, aktive lysosomer og kjerne. De fargede cellene var montert med ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) og avbildet ved bruk av et konfokalt laserskanningsmikroskop. Differensielle interferenskontrastbilder ble oppnådd ved bruk av et konfokalt laserskanningsmikroskop. 2.9.SA -Gal Activity Assay. SA -gal-aktiviteten ble undersøkt ved hjelp av en { {21}}brønncellulært senescensanalysesett (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), etter produsentens instruksjoner.

2.10. Musehåndtering og legemiddeladministrasjon.

Mus ble håndtert som beskrevet tidligere [18] i henhold til retningslinjene fra Dankook Animal Ethics Committee (Dankook IACUC,18-026).C57BL/6] hannmus i alderen 16 uker ble intraperitonealt injisert med rotenon (0 0,75 mg/kg kroppsvekt) og MLi-2 (en LRRK2-kinasehemmer; 1mg/kg kroppsvekt) en gang annenhver dag i to uker.

2.11.Rotarod-test og forberedelse av hjernevev.

På dag 14 etterbehandling ble musene plassert på en roterbar sylinderformet stang. Tiden det tok å falle til gulvet ble registrert. Detaljene til rotarod-testen er beskrevet andre steder [18]. Deretter ble musene avlivet og transkardialt perfusert med iskald HBSS inneholdende Ca2 og Mg. Mellomhjernen ble dissekert med mikrosaks og pinsett. Vevet ble lysert i PBS inneholdende 1 prosent Triton X-100,1xXpert Protease Inhibitor Cocktail Solution (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) og lx Xpert Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (P3200, GenDEPOT). Prøvene ble homogenisert ved bruk av en Pellet Pestles Cordless Motor (Sigma-Aldrich). Supernatanten ble utsatt for western blotting, SA-gal aktivitetsanalyse og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).

2.12.ELISA for Oligomer -Syn.

Tidligere hadde vi etablert en sandwich-ELISA for analyse av fibrillære -syn-oligomerer ved bruk av et antistoff som gjenkjenner den filamentøse konformasjonen til -syn-aggregater [17]. De rå midthjernelysatene ble utsatt for ELISA, og -syn-aggregatene ble kvantifisert ved å bruke -syn-fibrilstandarder.

2.13. Bilde- og dataanalyser.

Intensiteten til PLA og farging av levende celler ble målt ved bruk av Zen 2012 (Carl Zeiss). Densitometri av målproteinene ble utført ved bruk av

FIGUR 1: Rotenonindusert LRRK2-kinaseaktivering fremmer cellulær senescens i den differensierte humane neuroblastomcellelinjen. Western blotting-analyse av dSH-celler behandlet med 1 uM rotenon eller 1 uM GSK2578215A(GSK-K), en LRRK2-kinasehemmer, i 48 timer ved bruk av antistoffer mot målproteinene (a). Tetthetene til proteinene ble normalisert til de for -aktin (bg).n =3.(h) dSH-celler behandlet med 1 uM rotenon eller 1 uM GSK-KI i 48 timer ble utsatt for proximity ligation assay (PLA) av fosfo-S1292 LRRK2 og total IRRK2(PIA-pS1292) og immunfluorescens (TF) analyse av -galaktosidase, Nuclei ble farget med Hoechst 33342. Kontrollene brukt i PLA- og IF-farging avslørte validiteten til resultatene (to høyre paneler). Intensitetene til PLA-pS1292(i) og -galaktosidase (j) ble normalisert til 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4; antall celler= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokyo, Japan). Alle datasett ble analysert og grafisk ved bruk av Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Data fra eksperimenter utført med dSH-celler og primære kortikale nevroner fra rotter ble analysert ved hjelp av toveisanalyse av varians (ANOVA), etterfulgt av Bonferronis post hoc-test(n=3). I mellomtiden,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Alle data er representert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnitt. *s<><><><0.0001,and n.s.="not">

FIGUR 2: LRRK-kinaseinhibitor hemmer aktiveringen av p53 i den differensierte humane neuroblastomcellelinjen. (a) Helcellelysater (20 prosent), som ble brukt som input for immunutfelling (IP), og kjernefraksjon ble samlet. Analysen avslørte at 20 prosent input viste resultater som ligner de observert i figur 1. (b, c) IP-prøvene ble denaturert og utsatt for western blotting. TXR-stedets fosforyleringsnivåer i p53 ble normalisert til totale p53-nivåer. n=3.(de) Totale p53-nivåer i kjernen ble undersøkt ved bruk av western blotting. LaminB ble brukt for normalisering av kjernefysiske p53-nivåer. n=3.(f) mRNA-nivåene av p21 og pl6 i behandlingsgruppen ble normalisert til de i den bærer-(dimetylsulfoksid-)-behandlede gruppen,n =3.

Denne artikkelen er hentet fra Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, artikkel-ID 9969842, 16 sider https://doi.org/10.1155/2021/9969842