Nevrobeskyttende effekter og mekanismer av procyanidiner in vitro og in vivo del 2
Mar 21, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
3. Diskusjon
Tallrike studier har vist at PC-er viser sterke radikalfjernende og antioksidantaktiviteter ]25-27I, og at oksidativt stress forårsaket av overdreven produksjon av ROS og/eller svekkelse av antioksidantforsvarssystemet spiller en kritisk rolle i nevrodegenerative sykdommer [ -6,28,29]. Imidlertid er de nevrobeskyttende effektene og mekanismene til PC-er angående oksidativ skade fortsatt uklare. Derfor undersøkte denne studien effekten og mekanismene til PC-er i nevrobeskyttelse.
I denne studien forbedret de riktige konsentrasjonene av PC-er nivåene av antioksidantenzymer, inkludert GSH-Px, CAT og SOD, men reduserte nivåene av ROS og MDA i modeller av oksidativ skade sammenlignet med målinger med H, O, alene. Disse nåværende funnene stemte overens med tidligere studier som antydet at et lite PC-tilskudd via diett kan forbedre aktivitetene til GSH-Px, CAT og SOD hos avvente smågriser [30]. En annen studie antydet også at PC-er betydelig økte CAT- og SOD-aktiviteter og reduserte MDA-innhold, og dermed forbedret kvaliteten på geitesæd [31].
Cistanche kan forbedre immuniteten
Nrf2/ARE-veien er en betydelig antioksidantvei [32-34]. Normalt ligger Nrf2 i cytoplasmaet, hvor det er bundet til det hemmende proteinet Keap135,36]. Ved H2O2-stimulering dissosieres Nrf2 fra Keap1, initierer det endogene antioksidantforsvarssystemet og translokerer deretter inn i kjernen [34,37,38]. Den samhandler deretter med ARE for å aktivere en serie cellebeskyttende gener og antioksidantgener, inkludert GCLC, GCLM, NOO1 og HO-139,40]. Som svar på oksidativt stress, i likhet med endringer sett under H-O2-stimulering, dissosieres Nrf2 fra Keap1 i cytosolen og blir deretter translokert inn i kjernen, og binder seg til ARE-sekvensen for å aktivere transkripsjon av kryobeskyttende gener [41,42]. Vi observerte at de riktige konsentrasjonene av PC-er muliggjorde kjernefysisk lokalisering av Nrf2 under H, O2--lesjonsforhold i PC12-celler. Dessuten oppregulerte de passende konsentrasjonene av PC-er ekspresjonsnivåene til NOO1, HO-1, GCLM og GCLC, som alle direkte kan virke for å eliminere frie radikaler og oksidative molekyler [43]. Derfor viste disse resultatene at passende konsentrasjoner av PC-er økte nivåene av Nrf2/ARE-veien. Deretter ble Nfr2-gendemping via Nrf2 siRNA brukt for å vurdere rollen til Nrf2/ARE-aktivering i PC-mediert nevrobeskyttelse mot H, O 2-indusert oksidativ skade. Nrf2-siRNA-transfekterte celler indikerte en markant reduksjon i Nrf2-ekspresjon. Samtidig fant vi ut at Nrf2 knockout avskaffet PC-mediert beskyttelse mot H2O-behandlet svekkelse i cellelevedyktighet, og Nrf2 knockout avskaffet også antioksidanteffektene til PCer. Disse funnene var i samsvar med en tidligere studie som antydet at forbedring av aktivering av Nrf2/ARE-veien bidrar til nevrobeskyttelse [44]. Derfor indikerer de nåværende resultatene at Nrf2/ARE-veien kan representere et farmakologisk mål for PC-er for forebygging av nevrodegenerasjon.
4. Materialer og metoder 4.1. Kjemikalier og reagenser
H2O2 ble kjøpt fra HUSHI (HUSHI, Shanghai, Kina). CCK-8, NAC ble kjøpt fra Beyotime (Beyotime, Shanghai, Kina). PC-er,2',7/-diklorfluoresceindiacetat, MDA, GSH-Px, SOD-diagnosesett og CAT-diagnosesett ble kjøpt fra Solarbio (Solarbio, Beijing, Kina).RNAi Plus, PrimeScript RT-reagenssett med gDNA Eraser og SYBR Premix Ex Tag II ble kjøpt fra Takara (Takara, Shiga, Japan). Nrf2-siRNA, kontroll-siRNA og lipofectamine 2000 ble hentet fra GenePharma (GenePharma, Shanghai, Kina). Følgende primære antistoffer og tilsvarende sekundære antistoffer ble oppnådd fra Proteintech (Proteintech, Wuhan, Kina): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B og GAPDH.
4.2. Cellekultur
PC12-celler ble hentet fra National Collection of Authenticated Cell Cultures. Cellene ble holdt i DMEM-medium supplert med 10 prosent føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin (100 U/mL; 100 ug/mL) i en fuktet inkubator ved 37 grader med 5 prosent CO2.
4.3. Cellelevedyktighetsanalyser
PC12-celler ble sådd inn i 96-brønnplater med en tetthet på 1×104 celler/brønn. Cellene ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av PC-er eller NAC (20 μM) i 24 timer, hvoretter de ble inkubert med 200 μM H2O2, i 24 timer. Deretter ble 10 μLof CCK-8-løsning tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time, hvoretter absorbansen ble målt ved 450 nm.
4.4. Vedlikehold av fisk
Etisk godkjenning for bruk av dyr ble gitt av Animal Conservation and Use Committee ved det eksperimentelle dyresenteret ved Zhejiang University (ZJU20200125). Voksen sebrafisk (Danio rerio, AB-stamme) ble hentet fra laboratoriedyrsenteret ved Zhejiang University og holdt ved 28±1C under en 14/10-t lys/mørke-syklus [21J. Fisken ble fôret med Artemia nauplii to ganger daglig. For å produsere embryoer ble voksne sebrafisk plassert over natten i avlstanker i forholdet 1:1, hann:hun. Gyting ble utløst innen 2 timer etter at lysene ble slått på neste morgen. Embryoer ble oppdrettet i embryovann ved 28 grader [45].
4.5. ROS-mål
For å måle ROS-produksjon in vivo ble sebrafisklarver (AB-stamme), 3 dager etter befruktning (pdf) eksponert for NAC (30 μM) eller forskjellige konsentrasjoner av PC-er i fravær eller nærvær av 300 μM H,O, i 4 dager. Deretter, ved 7 pdf, ble de forskjellige behandlingsgruppene overført til en 24-brønnplate (10 sebrafisklarver per gruppe) behandlet med 20 uM 2',7'-diklorfluoresceindiacetatløsning, og ble inkubert i 60 minutter i mørket ved 28,5 grader C[46]. Deretter ble larvene vasket tre ganger med embryomedium for å fjerne overskudd av 2'7'-diklorfluoresceindiacetat. De fargede larvene ble deretter observert og avbildet under et Olympus laserskannende konfokalmikroskop. Den fluorescerende intensiteten til hver enkelt larve ble kvantifisert via Image] programvare.
For å måle ROS-produksjon In vitro ble PC12-celler sådd inn i 6-brønnplater med en tetthet på 2×10* celler/brønn. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av PC-er eller NAC (20 uM) i 24 timer og ble deretter inkubert med 200 uM HO i 24 timer. Cellene ble inkubert med 10 μM 2',7'-diklorfluoresceindiacetatløsning i mørke i 30 minutter; deretter ble fargestoffløsningen fjernet, og cellene ble vasket tre ganger i fosfatbufret saltvann. Cellene ble deretter observert og avbildet under et Olympus laserskannende konfokalmikroskop. De fluorescerende intensitetene til cellene ble kvantifisert via Image] programvare.
4.6. Vurdering av MDA, GSH-Px, SOD og CAT
Sebrafisklarver (AB-stamme) ved 3 pdf ble eksponert for NAC (30 μM) eller forskjellige konsentrasjoner av PC-er i fravær eller nærvær av 300 uM H2O, i 4 dager. 7 dpf sebrafisken ble bedøvet med tetrakain og homogenisert etter eutanasi på is. MDA, GSH-Px, CAT og SOD ble analysert samtidig, i henhold til produsentens instruksjoner. Hvert eksperiment inneholdt 20 larver, og hver målte indeks ble gjentatt i tre eksemplarer.
PC12-celler ble sådd inn i 6-brønnplater med en tetthet på 2 x 10* celler/brønn. Cellene ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av PC-er eller NAC (20 uM) i 24 timer og ble deretter inkubert med 200 uM H2O i 24 timer. PC12-celler ble deretter samlet og inkubert med lyseringsbuffer. MDA-, GSH-Px-, SOD- og CAT-aktiviteter ble målt ved å bruke tilsvarende analysesett, i henhold til hver produsents protokoller. Hver målt indeks ble gjentatt i triplikater.
4.7.Total RNA-ekstraksjon, omvendt transkripsjon og kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon
Sebrafisklarver (AB-stamme) ved 3 dpf ble utsatt for NAC (30 μM) eller forskjellige konsentrasjoner av PC-er i fravær eller nærvær av 300 uM H, O, i 4 dager. Etter behandlinger ble RNA ekstrahert ved bruk av RNAiso, etter produsentens instruksjoner. RNA ble omvendt transkribert ved bruk av et PrimeScript RT-sett med et gDNA-viskelær, etter produsentens instruksjoner (Takara, Shiga, Japan). Kvantitativ sanntids-PCR ble utført med et Applied Biosystems Vi-7 sanntids-PCR-system ved bruk av SYBR Premix Ex TaqII-aktin ble brukt som et referansegen, og relativ genuttrykk ble beregnet ved bruk av 2-AACt metode. Primersekvensene som brukes er oppført i tabell 1.
4.8. Nrf2 siRNA-transfeksjon
Nrf2-siRNA ble brukt til å slå ned Nrf2. PC12-celler ble sådd i 6-brønnkulturplater og ble deretter transfektert med Nrf2-siRNA (80 nM) eller kontroll-siRNA ved bruk av Lipofectamine 2000, i henhold til produsentens instruksjoner.
4.9.Forberedelse av helcelle-, cytoplasmatisk og nukleært protein
For helcelleproteinekstraksjon ble celler samlet og inkubert med RIPA-lysebuffer inneholdende 1 prosent PMSF og 1 prosent proteasehemmercocktail i 30 minutter på is. Cellelysater ble sentrifugert, og supernatanten ble samlet og lagret. For subcellulær fraksjoneringsforberedelse ble celleprøver behandlet ved bruk av kjernefysisk og cytoplasmatisk proteinekstraksjonssett. Proteininnholdet ble analysert ved å bruke BCA-analysen. 4.10.Western Blotting
Alikvoterte proteinprøver ble løst ved SDS-PAGE og overført til polyvinyliden-difluorid-membraner. Blottene ble deretter inkubert med følgende primære antistoffer: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B eller GAPDH. Membranen ble deretter vasket med TBST i 5 minutter; dette ble gjentatt 5 ganger. Deretter ble blots inkubert i peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Til slutt ble proteinbånd visualisert ved bruk av et ECL-pluss Western blotting-deteksjonsreagens.
4.11. Lokomotorisk atferdsanalyse
Sebrafisklarver (AB-stamme) ved 3 pdf ble eksponert for NAC (30 μM) eller forskjellige konsentrasjoner av PC-er i fravær eller tilstedeværelse av 300 μM HO, i 4 dager. Deretter, ved 7 pdf, ble disse behandlede larvene sådd ut i 24-brønnplater (én fisk per brønn og 12 larver per gruppe). Vi brukte Any-labyrint 4.73 for å måle den bevegelsesmessige oppførselen til sebrafisklarver, og beregnet den totale avstanden tilbakelagt på 10 minutter [47].
4.12.Statistisk analyse
Data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) for minst tre uavhengige eksperimenter. Enveis variansanalyse (ANOVA) og Duncans multiple range-tester ble brukt for å bestemme statistisk signifikans, og forskjeller ble ansett som signifikante når p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">
5. Konklusjoner
Avslutningsvis indikerer de nåværende funnene at PC-er utøver nevrobeskyttende effekter ved å aktivere Nrf2/ARE-veien og dens nedstrøms avgiftningsenzymer og antioksidantenzymer. Til sammen kan PC-er ha en beskyttende effekt på nevrodegenerative lidelser.
Forfatterbidrag:Konseptualisering, JCandJZ.(Jiajin Zhu); metodikk, JC; programvare, YC; validering, YZ., JZ(Jiawen Zhao) og HY; formell analyse, JC; undersøkelse, YC; ressurser, JZ(iajin Zhu); datakurering, JC; skriving—originalt utkast, JC; skriving – gjennomgang og redigering, JZ.(iajin Zhu); visualisering, JC; tilsyn, DL; prosjektadministrasjon, JZ(Jiajin Zhu); finansieringsoppkjøp, JZ(Jiajin Zhu). Alle forfattere har lest og samtykket til den publiserte versjonen av manuskriptet.
Finansiering:Denne forskningen mottok ingen ekstern finansiering.
Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:Studien ble utført i henhold til retningslinjene i Helsinki-erklæringen, og godkjent av Ethics Committee of Animal Conservation and Use Committee of the Experimental Animal Center ved Zhejiang University (ZJU20200125). Informert samtykkeerklæring: Ikke relevant.
Datatilgjengelighetserklæring:Data er inneholdt i artikkelen. Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Prøvetilgjengelighet: Prøver av forbindelsene er ikke tilgjengelige fra forfatterne.
Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules
