MikroRNA i nyreutvikling og sykdom Ⅲ

MiRNA i Wilms svulst

Wilms svulst,ellernefroblastom, er den vanligste barndommennyrekreft, med en forekomst på 1 av 10,000 barn i Nord-Amerika (111). Det er først og fremst en sporadisk sykdom, selv om familiære former forekommer i omtrent 1–2 % av tilfellene (112, 113). Wilms-svulster oppstår fra avvikende nefrogenese, der pluripotente embryonale nyreforløpere ikke klarer å differensiere og vedvarerunormalt inn i livet etter fødselen(111, 114, 115). Disse svulstene ligner histologiskutvikle nyrermed enforstyrret morfologi(116), og mutasjoner i gener involvert i føtal nefrogenese, inkludert WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) og TP53 (123, 124), er assosiert med omtrent 40 % av Wilms-svulster (125). Nyere studier som bruker hel-genom- og hel-eksom-sekvensering av Wilms-svulster identifiserte nye mutasjoner i kreftrisikogener (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), gener som koder for proteiner som medierer histonmodifikasjoner under nefrogenese (BCOR, MAP3K4) (126) ), og miRNA-prosesseringsgener (121, 122, 128, 129).

HVOR LANG TAR DET FOR CISTANCHE Å JOBBE FOR NYRESYKDOMSPASIENTER?

Blant miRNA-prosesseringsgenene er mutasjoner i DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 og XPO5 (koder for eksportin 5) blitt rapportert i behandlingsnaive og neoadjuvante kjemoterapi-behandlede Wilms-svulster (Figur 3) (121, 122, 12928, 12928, 129 ). Omtrent 33 % av Wilms-svulstene som ble undersøkt viser skadelige mutasjoner i gener fra miRNA-prosesseringsveien (128). En tilbakevendende hotspot-mutasjon (E1147K) i en met al-bindende (Mg2+) rest av RNase IIIb-domenet til DROSHA, som ser ut til å være unik for Wilms-svulsten, opphever den katalytiske aktiviteten til dette domenet, noe som resulterer i ufullstendig spaltning av pri-miRNA og redusert miRNA-modning (128). Somatiske hotspot-mutasjoner som påvirker RNase IIIb-domenet til DICER1 svekker behandlingen av 5p miRNA (de som stammer fra 5'-armen til pre-miRNA-hårnålen) (129) og blir ofte funnet som "andre hit"-mutasjoner som virker i tandem med DICER1 kimlinjemutasjoner for å indusere Wilms tumorigenese i DICER1 syndrom (en lidelse som øker mottakelighet for en rekke svulster) (130–132). Det er fortsatt uklart hvorfor svekket DICER1-funksjon i Wilms-svulster resulterer i vedvarende og avvikende nefrogenese, i motsetning til tapet av Dicer1 i musenefronforfedre, som forårsaker økt apoptose og for tidlig opphør av nefrogenese (72–75). Noen potensielle muligheter inkluderer at gendoseringsaktiviteten kan være avgjørende for å bestemme celleoverlevelse eller at mutasjoner i RNase IIIb-domenet kan påvirke spesifisiteten til miRNA-binding av DICER1.

Mutasjoner i miRNA-prosesseringsgener er assosiert med nedregulering av viktige miRNA, inkludert medlemmer av miR-200 (121) og let-7-familiene (Figur 3) (121, 129). La -7 miRNA og det RNA-bindende proteinet Lin28 fungere sammen for å kontrollere tidspunktet for opphør av murin nefrogenese, muligens via regulering av det vekstfremmende genet Igf2 (133). Overekspresjon av Lin28 under nyreutvikling forårsaker utvidelse av nefrogene stamceller, ved å hemme deres endelige differensieringsbølge, som kulminerer i neoplastisk transformasjon som minner sterkt om den humane Wilms-svulsten (134). Økt DNA-kopiantall av LIN28B og DNA-kopistap av let-7a sees i henholdsvis 25 % og 46 % av humane Wilms-tumorprøver (126). I tråd med disse observasjonene forårsaker kimlinjemutasjoner i det humane DISL3L2-genet, som koder for en exoribonuklease som er ansvarlig for å bryte ned forhåndsbehandlede former for let-7, Perlmans syndrom og disposisjon for Wilms-svulst (135, 136). Perlmans syndrom er et medfødt overvekstsyndrom karakterisert ved makrosomi, polyhydramnion, ansiktsdysmorfologi, nyredysplasi og nefroblastomatose (en forløperlesjon for Wilms-tumor) (137). Blant spedbarn med Perlman syndrom som overlever etter nyfødtperioden, utvikler 64 % Wilms-svulst (138). Interessant nok ble fullstendig eller delvis DISL3L2-delesjoner funnet i omtrent 30 % av sporadiske Wilms-svulster som ble undersøkt (136).

En fersk studie styrket betydningen av det regulatoriske miRNA-nettverket i etiologien til Wilms-svulsten. Forfatterne fant at pleiomorft adenom gen 1 (PLAG1) er et av de mest konsekvent oppregulerte genene i Wilms-svulster med mutasjoner i miRNA-prosesserende gener (125). Ektopisk ekspresjon av PLAG1 i den utviklende musenyren forårsaker neoplasi, som er ledsaget av transaktivering av dets målgen, Wilms tumoronkogen IGF2. miR-16 og miR-34, som er nedregulert i Wilms-svulster, ble identifisert som potensielle regulatorer av PLAG1-ekspresjon (125). Tabell 2 oppsummerer andre studier som har rapportert avvikende uttrykk for spesifikke miRNA-er assosiert med etiologien til Wilms-svulsten. Interessant nok kan disse miRNA-ene fungere som onkogener (kalt oncomiRs) eller tumorsuppressorer i settingen av Wilms tumorutvikling, avhengig av arten av målene deres.

MiRNA som potensielle biomarkører og terapeutiske midler

Bortsett fra deres intracellulære plassering, er miRNA også tilstede i betydelige mengder i biologiske væsker, inkludert blod, plasma, urin, morsmelk og spytt (139). Disse sirkulerende miRNA-ene finnes pakket aldret i mikropartikler (eksosomer, mikrovesikler og apoptotiske legemer) (140, 141), konjugert med AGO (142) eller nukleofosmin 1-proteiner (143), eller lastet inn i HDL (144), noe som gjør dem bemerkelsesverdig stabil selv under ugunstige forhold, som koking, ekstreme variasjoner i pH, forlenget lagring og flere fryse-tine-sykluser (145, 146). Dermed kan miRNA-signaturer i biologiske væsker reflektere assosiasjoner til fysiologiske eller sykdomstilstander (147). Sammen gjør disse funksjonene sirkulerende miRNA-er attraktive for bruk som ikke-invasive biomarkører for sykdomsdiagnose og prognose.

Sirkulerende miRNA-er kan ekstraheres direkte fra ufraksjonerte biologiske væsker eller ekstracellulære larvesikkelpreparater ved å bruke kommersielt tilgjengelige ekstraksjonssett (148) eller TRIzol (149). Ved isolering kan miRNA lagres ved -70 grader og forbli stabile i opptil 1 år (148). Det er flere plattformer tilgjengelig for miRNA-profilering, inkludert mikroarray-hybridisering, qPCR og neste generasjons sekvensering (150). Microarray og qPCR er de mest brukte metodene for å undersøke uttrykket av kjente miRNA (151). Begge metodene har fordelene ved å være enkle å bruke, relativt raske fra RNA-merking til datagenerering, og relativt kostnadseffektive (152). Imidlertid er de avhengige av tilgjengeligheten og nøyaktig annotering av miRNA-sekvenser i databaser for probe- og primerdesign (150). Selv om det er dyrere, muliggjør neste generasjons sekvensering samtidig påvisning av både kjente og nye miRNA-arter og tilbyr høy følsomhet (153). Videre muliggjør enkeltnukleotidoppløsningen til neste generasjons sekvensering identifisering av isomiRs, som er modne miRNA-isoformer som skiller seg fra kanoniske i lengde, sekvens eller begge (154, 155), som endrer målrettingsspesifisiteten til miRNA ( 156).

Ulike studier har undersøkt potensialet til sirkulerende miRNA som biomarkører for pediatriske nyresykdommer (157–160). For eksempel identifiserte en studie 14 miRNA-er som var betydelig oppregulert i serumet til pasienter med Wilms-svulst. Interessant nok kan en signatur basert på miR-100-5p og miR-130-3p uttrykk kunne skille disse pasientene fra friske kontroller med nøyaktighet, sensitivitet og spesifisitet (159). Selv om funnene fra denne studien og mange andre studier har gitt overbevisende motivasjon til å utforske potensialet til sirkulerende miRNA som biomarkører, må flere hindringer i feltet overvinnes før utbredt klinisk anvendelse. For det første er det en relativ mangel på konsensus mellom studier sannsynligvis på grunn av fraværet av standardisert metodikk for rensing (161) og analyse av prøver (f.eks. forskjeller i miRNA-profileringsplattformer, ref. 162, 163; eller forskjeller i smRNA-Seq-biblioteket forberedelsesmetoder, ref. 164). For det andre er mangelen på studier i stor prøvestørrelse og detaljerte undersøkelser på spesifikkesykdommer.Et annet viktig aspekt er at påvirkningen av forvirrende variabler som alder, kjønn og eksterne faktorer (f.eks. tobakk, alkohol, etc.) på miRNA-profiler ikke er fullt ut utforsket (for en grundig gjennomgang, se ref. 165).

På den terapeutiske siden er flere miRNA-baserte legemidler for tiden i kliniske studier, men de har ikke fått FDA-godkjenning ennå (166, 167). Hovedtilnærmingene for miRNA-terapi involverer gjenoppretting av miRNA-nivåer ved hjelp av miRNA-mimikere, eller hemming av spesifikke miRNA-er ved bruk av antagomiR-er (168). En av utfordringene knyttet til utviklingen av miRNA-baserte terapier er identifiseringen av miRNA-kandidater for hver sykdom. Fordi flere miRNA-er er dysregulert i hver sykdom, bør det utføres en nøye analyse av pasientprøver i kombinasjon med in vitro- og in vivo-analyser som adresserer de patofysiologiske mekanismene som påvirkes av de aktuelle miRNA-ene for å begrense kandidat-miRNA-ene for terapeutisk intervensjon (168, 169). En annen utfordring innebærer utvikling av strategier for å forbedre in vivo-stabilitet og stedsspesifikk medikamentlevering med minimal toksisitet og effekter utenfor målet. RNA-molekyler er kjemisk ustabile på grunn av tilstedeværelsen av 2′-hydroksylgruppen på pentoseringen. For å gi høyere stabilitet og beskyttelse mot nukleaser som er tilstede i serum eller det endocytiske rommet til celler, har bioteknologiselskaper generert RNA-molekyler med kjemiske modifikasjoner (2'-O-metylgruppe, fosfortioat eller låste nukleinsyrer) i ryggraden (166). Når det gjelder in vivo-levering, inkluderer teknologier lipidbasert (f.eks. lipidnanopartikkel og nøytral liposom) og dendrimerer konjugert til en målrettingsdel, blant mange andre strategier. Store utfordringer knyttet til miRNA-leveringssystemer er immunotoksisitet og målspesifikk affinitet mot et sykdomssted (170). Tilførselsstrategier ved ulike administrasjonsmetoder (intraperitoneale, intravenøse og subkutane injeksjoner) eller ved bruk av vektorer som inneholder nyrespesifikke og induserbare promotorer har blitt brukt med hell for selektiv nyremålretting og for å unngå potensielle bivirkninger i andre vev og organer (171, 172) ).

Tabell 2. Liste over miRNA endret i Wilms-svulst

Liste over miRNA, prøver/prøver analysert, miRNA-nivåer observert i disse prøvene/prøvene sammenlignet med passende kontroller, målgen, konsekvenser av miRNA-endringer og referanser. CAMKK2, kalsium/kalmodulin-avhengig proteinkinase kinase 2; CDC7, celledelingssyklus 7; CDH1, cadherin 1; CREB1, cAMP-respons element-bindende protein 1; EYA1, øyne fraværende homolog 1; E2F3, E2F transkripsjonsfaktor 3; FRS2, FGF-reseptorsubstrat 2; Glut1, glukosetransportør 1; IGF1R, IGF1-reseptor; Jag1, tagget1; MET, mesenkymal-epitelial overgang; MKNK1, MAPK-interagerende serin/treoninkinase 1; PTEN, fosfatase og tensin homolog; PUMA, p53-oppregulert modulator av apoptose; p73, tumorprotein p73; SIX1, sineoculis homeobox homolog 1; TGFBR1, TGF-reseptor 1; WT, Wilms-svulst.

Sammendrag

Det har vært en eksplosjon av informasjon om miRNA-biogenese, regulering av miRNA-ekspresjon og miRNA-funksjon siden den første oppdagelsen av miRNA-er i 1993 (6, 7). Dette har blitt ledsaget av en stadig økende forståelse av hvordan miRNA fungerer både i normal fysiologi og i patofysiologien til mange sykdommer. Det har blitt klart at dysregulering av miRNA-ekspresjon forstyrrer tidlig nyreutvikling og er implisert i patogenesen av utviklingsmessige nyresykdommer, slik som CAKUT og Wilms tumor. Med nyere utvikling i bruken av miRNA som biomarkører og som nye medikamentmål, er innsikt i hvordan miRNA regulerer nyreutvikling og sykdom avgjørende for å forstå hvordan de kan brukes i nye diagnostiske og terapeutiske tilnærminger til disse sykdommene. For å realisere denne innsatsen fullt ut, er fremtidige studier som identifiserer funksjonen til spesifikke miRNA-er i nyreutvikling avgjørende, i tillegg til teknologier for å optimalisere målretting av små oligonukleotid-terapier til nyrene

Anerkjennelser

JHs laboratorium er støttet av tilskudd fra NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK125015 og R01DK102843). DMC ble støttet av Nephrotic Syndrome Study Network Career Development Award og Children's Hospital of Pittsburgh Research Advisory Council Postdoctoral Fellowship. MT ble støttet av University of Pittsburgh Summer Research Internship Program (R25DK119180). Figurene ble laget med BioRender.com. Adresser korrespondanse til: Jacqueline Ho, avdeling for nefrologi, Department of Pediatrics, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, USA. Telefon: 412.692.9440; E-post: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A, et al. miRBase: fra mikroRNA-sekvenser til funksjon. Nucleic Acids Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC, et al. De fleste pattedyr-mRNA-er er konserverte mål for mikroRNA-er. Genome Res. 2009;19(1):92–105.

3. Ghildiyal M, Zamore PD. Små dempende RNA-er: et ekspanderende univers. Nat Rev Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovic S, et al. miRNA-mediert gendemping ved translasjonsundertrykkelse etterfulgt av mRNA-deadenylering og forfall.

Vitenskap. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Gendemping av mikroRNA: bidrag fra translasjonsundertrykkelse og mRNA-forfall. Nat Rev Genet. 2011;12(2):99–110. 6. Lee RC, et al. C. elegans heterokrone gen lin-4 koder for små RNA med antisense komplementaritet til lin-14. Celle.