Del 1|Glykogensyntase kinase 3b hyperaktivitet i eksfolierede urinceller forutsier progresjon av diabetisk nyresykdom

Xianhui Liang, et al

1Blood Purification Center, Institute of Nephrology, det første tilknyttede sykehuset ved Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina; 2 Institutt for medisin, avdeling for nyresykdom og hypertensjon, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, USA; og 3 Institutt for medisin, avdeling for nefrologi, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio, USA

For mer informasjon vennligst kontakt:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å få prøven

Nye bevis peker på glykogensyntasekinase(GSK)3b som en nøkkelaktør innen mangfoldnyresykdommer. Imidlertid, som en sentral transduser av insulinsignalveien, er rollen til GSK3b hos diabetikerenyre sykdomforblir usikker. Hos DB/DB-mus ble nyreekspresjonen av totalt og aktivert GSK3b økende forhøyet. Dette gikk forut for utviklingen av diabetikerenyre sykdomog korrelert med progresjonen av tegn pådiabetikernyreskade, inkludert albuminuri og ekstracellulær matriseakkumulering i glomeruli og tubulointerstitial. In vitro induserte eksponering av glomerulære podocytter, mesangiale celler og renale tubulære celler til et diabetisk miljø GSK3-booverekspresjon og hyperaktivitet, som virker avgjørende og tilstrekkelig for å fremkallediabetikercellulære skader i nyreceller, fordi den cytopatiske effekten av det diabetiske miljøet ble dempet av GSK3b knockdown, men ble etterlignet av ektopisk ekspresjon av konstitutivt aktivt GSK3b selv i det normale miljøet. Inkonsekvens, nyrebiopsiprøver tatt fra pasienter med varierende stadier av diabetisk nefropati avslørte et forsterket uttrykk av totalt og aktivert GSK3b i glomeruli og nyretubuli, assosiert med alvorlighetsgraden av diabetisk nefropati. I retrospektive kohorter av type 2-diabetespasienter som ble fulgt i over fem år, representerte dessuten den relative aktiviteten til GSK3b i eksfolierede urinceller en uavhengig risikofaktor for utvikling eller progresjon av nedsatt nyrefunksjon. Videre viste mottakeroperasjonskarakteristisk kurveanalyse at GSK3b-aktivitet i urineksfolierte celler ga mye bedre kraft enn albuminuri hos diabetikere med progressiv nyresvikt som skiller fra de med stabil nyrefunksjon. Dermed blir nyreekspresjon og aktivitet av GSK3b forsterket i eksperimentell og klinisk diabetisk nefropati. Derfor kan GSK3b i urineksfolierede celler tjene som en ny biomarkør for å forutsi diabetikernyresykdomprogresjon.

Diabetisk nyresykdom(DKD) fortsetter å være en ledende årsak til nyresvikt i sluttstadiet i USA og andre utviklede land.1,2 Det er imidlertid ikke alle pasienter med diabetes mellitus som utvikler diabetisk nefropati (DN), som det fremgår av en rekke lang- term epidemiologiske oppfølgingsstudier.3 Årsaken til dette heterogene utfallet er ikke fullt ut forstått, men tilsynelatende multifaktoriell, som involverer ulike årsaksfaktorer, inkludert genetikk, miljøer, eksisterendenyresykdom, og alvorlighetsgraden av diabetes.4,5 Dårlig glykemisk kontroll har vært en velkjent risikofaktor for albuminuri og DN. Likevel utvikler en betydelig del av pasientene fortsatt DN til tross for stram glykemisk kontroll.6 I klinisk praksis er det nødvendig å ta i bruk en sensitiv og presis biomarkør for å stratifisere diabetespasienter med risiko for å utvikle seg til nedsatt nyrefunksjon. Albuminuri har i årevis vært ansett som en surrogatmarkør for diabetiske nyrekomplikasjoner.7,8 Likevel tyder en økende mengde bevis på at albuminuri kanskje ikke er nøyaktig.9,10 Det er observert en signifikant uoverensstemmelse mellom albuminuri og nedsatt nyrefunksjon i DN. 11,12 I følge dataene fra United Kingdom Prospective Diabetes Study,13 av de pasientene som utviklet nedsatt nyrefunksjon, hadde 61 prosent ikke albuminuri på forhånd og 39 prosent utviklet aldri albuminuri under studien. På samme måte, av de pasientene som utviklet albuminuri, utviklet bare 24 prosent senere nedsatt nyrefunksjon under studien. Med andre ord, for pasienter med mikroalbuminuri eller makroalbuminuri kan det hende at den rådende majoriteten ikke utvikler nyresvikt. Disse dataene utfordrer dermed det klassiske paradigmet med albuminuri som alltid går foran nyresvikt under progresjonen av DKD. Som sådan er det viktig å identifisere nye biomarkører.

for å forutsi DN eller for tidlig diagnose av DN. I løpet av det siste tiåret har en rekke nye molekyler blitt testet.14–16 Blant disse har glykogensyntasekinase 3 (GSK3) dukket opp som en attraktiv kandidat. GSK3 er en svært konservert, allestedsnærværende uttrykt serin/treonin-proteinkinase som opprinnelig ble karakterisert for å være en nøkkeltransduser av insulinsignaleringskaskaden og styrer glykogenesen. Interessen for GSK3 økte sterkt med erkjennelsen av at den også fungerer som et konvergenspunkt for flere cellesignalveier involvert ibetennelse, immunmodulering, embryogenese, vevsskade, reparasjon og regenerering.17–19 GSK3 eksisterer som 2 isoformer: GSK3a og GSK3b. I forskjellige organvev er de 2 isoformene forskjellig uttrykt. I nyrebarken er b-isoformen hovedsakelig uttrykt og lokalisert til glomeruli og proksimale tubulære celler.20,21 Renal GSK3b-overaktivitet har vært assosiert med et mangfold av nyresykdommer, inkludert proteinuriske Glo-nevropatier og progressiv kronisk nyresykdom.22 Likevel , som en nøkkeltransduser av insulinsignalveien, er rollen til GSK3b i patogenesen av DN ennå ukjent. Det gjenstår å avgrense om GSK3b-dysregulering i nyren er involvert i DN. For å løse dette problemet undersøkte denne studien ekspresjonsprofilene for total og aktivert GSK3b i nyreprøver hentet fra dB/dB murine modeller av ikke-insulinavhengig DN og i nyrebiopsivev fra pasienter med forskjellige stadier av type 2 DN. I tillegg, i retrospektive kohorter av pasienter med type 2-diabetes, ble ekspresjonsnivåene av total og aktivert GSK3b målt i eksfolierede urinceller, som ble tatt ut som en urinbasert flytende nyrebiopsi. Vi undersøkte forholdet mellom ekspresjonsnivåene av GSK3b eller dets aktiverte form i baseline urineksfolierede celler og utvikling eller progresjon av nedsatt nyrefunksjon hos diabetespasienter.

RESULTATER

GSK3b er overuttrykt og hyperaktiv i nyreparenkymceller hos db/db mus, assosiert med progresjon av albuminuri og diabetisk nyreskade

db/db mus med leptinreseptormangel er veletablerte modeller for type 2 diabetes mellitus og DN. Fra og med 10 ukers alder utvikler db/db mus spontant tidlige tegn pånyreskader, preget av progressiv albuminuri og matriseakkumulering i glomeruli.23 Derimot har alderstilpassede kontrollmus (db/m) normal glykemi og ingen merkbare tegn pånyresykdom. I et eksperiment som startet ved 10 ukers alder, ble nyreekspresjonen av totalt (Figur 1) og aktivert (Figur 2) GSK3b (fosforylert ved Y216 [p-GSK3B]) i db/db mus versus kontroll db/m mus progressivt forhøyet ( Figur 1b og 2b). Dette var hovedsakelig lokalisert til podocytter og mesangiale celler i glomeruli (Figur 1a) og til tubulære epitelceller i tubulointerstitial (Figur 2a), som vist ved immunhistokjemifarging. De morfologiske funnene ble bekreftet ved immunoblotanalyse av helnyrehomogenater (figur 1c og 2c). Regresjonsanalyse viste at fargingsintensiteten til total (Figur 1d) og aktivert (Figur 2d) GSK3b i glomeruli positivt korrelerte med urinutskillelsen av albuminuri i db/db mus i forskjellige aldre. Selv på det tidlige stadiet av diabetes hos db/db-mus, slik som ved 10 eller 14 ukers alder, var aktiviteten til GSK3b fremtredende forhøyet i nyrene, noe som gjenspeiles av en signifikant induksjon av p-GSK3b (Figur 2). Det ser ut til at GSK3b-hyperaktivitet i nyrene til db/db-mus på det tidlige stadiet i stor grad skyldtes post-translasjonelle modifikasjoner, slik som fosforylering ved Y216, men i et senere stadium skyldtes det hovedsakelig økt ekspresjon av total GSK3b.

Progresjonen av DN har økende akkumulering av den ekstracellulære matrisen i både glomeruli og interstitiell. Faktisk, som vist ved FL-fluorescerende immunhistokjemifarging, demonstrerte db/db musenyrer progressivt økt ekspresjon av fibronektin i både glomeruli og interstitiell (figur 3a). Dette ble ytterligere bekreftet ved immunoblotanalyse av nyrehomogenater for fibronektin og kollagen IV (figur 3b og c). Dessuten korrelerte uttrykk for totalt og aktivert GSK3b positivt med det for fibronektin inyrevev(Figur 3d).

For ytterligere å bestemme om forbedret GSK3b-aktivering går foran utviklingen av DKD, ble db/db og db/m mus fulgt opp i et eget eksperiment som startet ved 4 ukers alder under prediabetesstadiet. Ved uke 7 viste db/db-mus tydelig hyperglykemi (tilleggsfigur S1A), noe som tyder på diabetes, men ingen tegn på DKD, som vist ved normal albuminuri (tilleggsfigur S1B). Det er verdt å merke seg at selv i et så tidlig stadium av diabetes hadde nyreekspresjonen av GSK3b og p-GSK3b samt den relative aktiviteten til GSK3b uttrykt som p-GSK3b/GSK3b-ratio, økt varierende, målt ved immunoblotanalyse av nyrebiopsivev etterfulgt av densitometri (tilleggsfigur S1C og D). I tillegg viste lineær regresjonsanalyse at nyre-GSK3b-aktivitet ved uke 7 korrelerte positivt med utviklingen av albuminuri og DKD ved uke 13 (tilleggsfigur S1E). Dessuten viste mottakeroperasjonskarakteristik (ROC) kurveanalyse at nyre-GSK3b-aktivitet i db/db-mus ved 7 ukers alder, når det ikke var tegn på DKD, ga utmerket nøyaktighet og kraft i å forutsi utviklingen av albuminuri og DKD (tilleggsfigur). S1F).

Eksponering av nyreceller for et diabetisk miljø forårsaker overekspresjon og hyperaktivitet av GSK3b, noe som resulterer i diabetiske cytopatiske endringer

For å avgjøre om diabetisk tilstand direkte forbedrer GSK3b-aktivering inyreceller, ble in vitro-kulturer av forskjellige nyrecellelinjer, inkludert murine podocytter, mesangiale celler og tubulære epitelceller, brukt og eksponert for et diabetisk miljø som består av høy omgivelsesglukose og transformerende vekstfaktor (TGF) b1. Eksponering av podocytter for det diabetiske miljøet resulterte i slående podocyttskade, preget av tap av podocyttmarkørproteinet synaptopodin. Dette var samtidig leie med fremtredende induksjon av total og aktivert GSK3b, som vist ved FL-fluorescerende immuncytokjemifarging (figur 4a og b) og bekreftet ved immunoblotanalyse

(Figur 4c og d). I dyrkede mesangiale celler ble ekspresjon av totalt (Figur 5a) og aktivert (Figur 5b) GSK3b likeledes forsterket etter eksponering for det diabetiske miljøet, parallelt med økt ekspresjon av ekstracellulære matrisemolekyler som fibronektin (Figur 5). Tilsvarende overuttrykte dyrkede renale tubulære epitelceller totalt og aktivert GSK3b etter diabetisk miljøbehandling, og dette ble ledsaget av tubulær celledysfunksjon og dedifferensiering, preget av redusert og forstyrret ekspresjon av epiteliale tight junction-molekyler som zonula occludens -1 -1) (Figur 6a–d). I motsetning til dette, som en osmolalitetskontroll, resulterte mannitolbehandling av alle nyreceller i en effekt som ikke var forskjellig fra den som ble formidlet av det normale miljøet som inneholdt normal omgivelsesglukose. Menneskelig diabetes involverer ikke bare hyperglykemi, men også insulinresistens. Selv om det er umulig å skille hyperglykemi fullstendig fra insulinresistens i dyremodeller eller hos pasienter, har in vitro-modeller blitt utnyttet for å undersøke den isolerte effekten av høy glukose versus insulinresistens. For å etterligne tilstanden til insulinresistens, ble b-isoformen til insulinreseptoren slått ned i dyrkede podocytter, mesangiale celler og renale tubulære celler (tilleggsfigur S2A–C), og dette forsterket uttrykket og aktiviteten til GSK3b selv i normalen. miljø, som vist ved immunoblotanalyse og densitometri. Denne virkningen ble forsterket etter eksponering for det diabetiske miljøet, og angir en synergistisk effekt av insulinresistens og høy glukose på aktivering av GSK3b.

GSK3b-hyperaktivitet er avgjørende og tilstrekkelig for nyrecelleskade og dysfunksjon fremkalt av diabetikermiljøet

For å utforske om GSK3b-hyperaktivitet er involvert i cytopatiske endringer i nyreceller, GSK3b-aktivitet idyrket nyreceller ble kunstig manipulert av RNA-interferens

(RNAi) eller genoveruttrykk. Som vist i figur 7a, påvirker RNAi ved bruk av små, forstyrrende RNA knapt den cytopatiske effekten av det diabetiske miljøet i alle nyreceller. I motsetning opphevet GSK3b-demping i stor grad den diabetiske miljø-initierte synaptopodin-undertrykkelse i podocytter, fibronektin-induksjon i mesangiale celler og ZO-1-forstyrrelser i renale tubulære celler, noe som tyder på at GSK3b sannsynligvis er avgjørende for å utløse diabetesrelaterte cytopatiske endringer i nyreceller. For å skjelne om GSK3b-overekspresjon og hyperaktivitet er tilstrekkelig for de cytopatiske effektene indusert av det diabetiske miljøet, ble celler forbigående transfektert med enten en tom vektor eller en vektor som koder for den konstitutivt aktive mutanten av GSK3b (S9A). Selv om tom vektortransfeksjon knapt utøvde noen effekt, resulterte ektopisk overekspresjon av S9A i tap av synaptopodin-ekspresjon i podocytter, økt fibronektinproduksjon i mesangiale celler og redusert ZO-1-ekspresjon i renale tubulære celler selv i det normale miljøet (figur 7b), som minner om den cytopatiske effekten av det diabetiske miljøet.

Progresjon av humant DN sammenfaller med GSK3b-overuttrykk og hyperaktivitet i nyrenes glomeruli og tubuli

For ytterligere å validere om funnene ovenfor i dyre- og cellekulturmodeller også er anvendelige for klinisk DN, ble arkivert nyrebiopsivev fra normale forsøkspersoner og pasienter med varierende stadier av DN behandlet for peroksidase-immunhistokjemifarging for GSK3b og p-GSK3b. Egenskapene til kontrollpersoner og pasienter er oppsummert i tilleggstabell S1. Som vist i figur 8a, nyre

ekspresjon av total og aktivert GSK3b ble i økende grad forsterket sammen med DN-progresjon som gradert i henhold til den patologiske klassifiseringen basert på periodic acid-Schiff-farging. Dette er i samsvar med Nephroseq-dataene, som også viser et betydelig økt GSK3b-uttrykk i nyrebiopsivev fra pasienter med DN (tilleggsfigur S3). Det økte uttrykket av total og aktivert GSK3b var hovedsakelig lokalisert til podocytter og mesangiale celler i glomeruli og til renale tubulære epitelceller i tubulointerstitial (Figur 8a), i samsvar med funnene i db/db-mus. De morfologiske resultatene ble ytterligere bekreftet av datastyrt morfometrisk analyse, som avslørte en positiv assosiasjon mellom ekspresjonsnivåene av totalt (Figur 8b) eller aktivert (Figur 8c) GSK3b og alvorlighetsgraden av DN.

GSK3b er hyperaktiv i urineksfolierede celler samlet inn fra diabetespasienter og forutsier progresjon av nedsatt nyrefunksjon Under både fysiologiske og sykdomstilstander skjer omsetning og utskillelse av nyreepitelceller, som glomerulære podocytter og tubulære epitelceller, konstant, noe som fører til kontinuerlig utskillelse av nyreparenkymceller inn i urinen. Urineksfolierede celler har blitt utnyttet med suksess som urinbasert ikke-invasiv flytende nyrebiopsi for forsknings- og diagnostiske formål.24,25 Forutsatt de nevnte funnene at ekspresjon av total og aktivert GSK3b er økt i nyreparenkymceller hos pasienter med DN og i DB/DB mus selv på et tidlig stadium før albuminuri manifesterte seg, lurte vi på om måling av GSK3b i urineksfolierte celler kunne brukes til å forutsi

utviklingen eller progresjonen av menneskelig DKD. For dette formål brukte vi biobanken for diabetes og gjennomførte en retrospektiv kohortstudie. Totalt ble 127 pasienter med type 2 diabetes mellitus, som hadde blitt fulgt opp ved det første tilknyttede sykehuset ved Zhengzhou University siden 2010 med innlagte prøver av fraksjonert urin, screenet for inkludering i denne studien. Av disse pasientene ble 67 ekskludert, med 10 tapt for oppfølging, 52 hadde nyredysfunksjon eller åpenbar proteinuri ved sykdomsstart, og 5 ble senere diagnostisert som andre nyresykdommer ved nyrebiopsi eller bildediagnostikk. Til slutt ble 60 pasienter inkludert i denne retrospektive kohortstudien (figur 9). De demografiske og kliniske egenskapene til disse pasientene ved baseline er oppsummert i tabell 1. Ingen av pasientene hadde nyredysfunksjon eller åpenbar proteinuri ved baseline, og ingen startet dialysebehandling i løpet av oppfølgingsperioden. I henhold til omfanget av albuminuri ble pasientene kategorisert i 2 undergrupper: normoalbuminuri og mikroalbuminuri grupper. Bortsett fra urinalalbumin-utskillelsesnivåer (UAE), var de 2 undergruppene av pasienter ikke statistisk forskjellige ved baseline i alle andre kliniske, biokjemiske og fysiologiske parametere, inkludert varighet av diabetes, glykert hemoglobinnivå, nyrefunksjon, blodtrykk og foreskrevne behandlinger . Etter 5 års oppfølging viste 29 av de 60 pasientene progresjon av nedsatt nyrefunksjon, som ble definert som enten en $25 prosent reduksjon i estimert glomerulær filtrasjonshastighet (eGFR) eller progresjon av albuminuristatus som indikert av eskaleringen av alvorlighetsgraden av albuminuri langs ulike kliniske stadier av DN, det vil si normoalbuminuri, mikroalbuminuri, mikroalbuminuri eller åpenbar proteinuri. Derimot viste de resterende 31 pasientene ingen tegn på progresjon av nyresykdom (figur 9). Pasientenes baselinedata ble stratifisert i henhold til progresjonsstatus for nedsatt nyrefunksjon etter 5 års oppfølging (tabell 2). Pasienter med progresjon av nedsatt nyrefunksjon, sammenlignet med de uten progresjon, viste en signifikant reduksjon i eGFR og en markant økning i UAE. For å bestemme om GSK3b ble overuttrykt eller overaktivert i nyreceller og

målt for å evaluere sensitiviteten og spesifisiteten til GSK3b-aktivitet i eksfolierede urinceller i forhold til baseline-albuminuri for å forutsi utviklingen av nedsatt nyrefunksjon. Som vist i figur 11, viste den relative aktiviteten til GSK3b i urineksfolierede celler, uttrykt som p-GSK3b/GSK3b-forhold, utmerket nøyaktighet og kraft i å skille pasienter med progressiv nyresvikt fra de med stabil nyrefunksjon, med området under ROC. kurven er 0.844 (95 prosent konfidensintervall, 0.747–0.941; P ¼ 0.001 ), som var mye bedre enn området under ROC-kurven for baseline Ln(UAE) ({{20}},750; 95 prosent konfidensintervall, 0,626–0,874). Cutoff som maksimerte Youdens indeks var 1,24 for p-GSK3b/GSK3b-forholdet og 76 mg/24 timer for UAE. Ved disse grensene var sensitiviteten og spesifisiteten 69 prosent og 87,1 prosent for p-GSK3b/GSK3b-forholdet og 69 prosent og 77,4 prosent for Ln(UAE). Dessuten forbedret kombinasjonen av p-GSK3b/GSK3b-forholdet med det totale GSK3b-nivået i urineksfolierte celler den diskriminerende kraften betydelig, med arealet under ROC-kurven på 0,971 (95 prosent konfidensintervall, 0,931–1.{{48} }). Disse resultatene tyder på at målinger av GSK3b-aktivitet i eksfolierede urinceller kan gi mye bedre nøyaktighet enn UAE når det gjelder å forutsi utviklingen av nedsatt nyrefunksjon hos diabetespasienter.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 timer). Urineksfolierede celler som var samlet ved baseline ble hentet og undersøkt ved immunoblotanalyse for GSK3b og p-GSK3b (tilleggsfigur S4A og B). Aktiviteten til GSK3b ble estimert av de densitometriske forholdene mellom p-GSK3b til total GSK3b for hver prøve i forhold til verdien av kontrollprøver (tilleggsfigur S4C).

Blant ulike kliniske/biokjemiske variabler ble GSK3b-aktivitet (p-GSK3b/GSK3b-forhold) i eksfolierede urinceller ved baseline bemerket å være signifikant høyere hos pasienter som utviklet DKD enn hos de som ikke gjorde det (tilleggstabell S3). Videre antyder ROC-kurveanalyse at den relative aktiviteten til GSK3b (p-GSK3b/GSK3b-forhold) i eksfolierede urinceller ga utmerket nøyaktighet og kraft i å forutsi utviklingen av DKD hos diabetespasienter i tidlig stadium (tilleggsfigur S4D).