Del 1: Acteosid undertrykker RANKL-mediert osteoklastogenese ved å hemme C-Fos-induksjon og NF-KB-bane og dempe ROS-produksjon
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Abstrakt
Tallrike studier har rapportert at inflammatoriske cytokiner er viktige mediatorer for osteoklastogenese, og derved forårsaker overdreven benresorpsjon og osteoporose.Acteosid fra cistanche urt, den viktigste aktive forbindelsen til Rehmannia glutinosa, som brukes mye i tradisjonell orientalsk medisin, har antiinflammatoriske og antioksidantpotensialer. I denne studien fant vi detakteosidmarkant hemmet osteoklastdifferensiering og dannelse fra benmargsmakrofager (BMM) og RAW264.7 makrofager stimulert av reseptoraktivatoren til nukleær faktor-kappaB (NF-kB) ligand (RANKL).Acteosidforbehandling forhindret også benresorpsjon av modne osteoklaster på en doseavhengig måte. Acteosid (10 mM) svekket RANKL-stimulert aktivering av p38-kinase, ekstracellulære signalregulerte kinaser og c-Jun N-terminal kinase, og undertrykte også NF-kB-aktivering ved å hemme fosforylering av p65-underenheten og inhibitoren kBa. I tillegg RANKL-mediert økning i ekspresjonen av c-Fos og nukleær faktor av aktiverte T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1), og i produksjonen av tumornekrosefaktor-a, interleukin (IL)-1b , og IL-6 ble tilsynelatende hemmet av akteosid-forbehandling. Videre muntligakteosidredusert ovariektomi-indusert bentap og inflammatorisk cytokinproduksjon for å kontrollere nivåene. Våre data tyder på at acteosid hemmer osteoklastdifferensiering og modning fra osteoklastiske forløpere ved å undertrykke RANKL-indusert aktivering av mitogenaktiverte proteinkinaser og transkripsjonsfaktorer som NF-kB, c-Fos og NFATc1. Samlet antyder disse resultatene at acteosid kan fungere som et anti-resorptivt middel for å redusere bentap ved å blokkere osteoklastaktivering.
Introduksjon
Bein omdannes konstant ved balansert osteoklast- og osteoblastaktivitet [1]. Osteoklaster oppstår fra hematopoietiske forløperceller fra monocytt/makrofag-linjen, mens osteoblaster er av mesenkymal-linjen [2]. Unormal osteoklastaktivering eller redusert osteoblastogenese kan forstyrre benhomeostase, og til slutt forårsake sykdommer som osteoporose, leddgikt og beinkreft [3,4]. Osteoporose er en vanlig skjelettsykdom som fører til økt risiko for brudd. Den vanligste formen for osteoporose er forårsaket av østrogenmangel hos kvinner i overgangsalderen. Medisiner som kortikosteroider og antiepileptika kan også forårsake ubalanse mellom benresorpsjon og bendannelse, noe som kan resultere i osteoporose [5].
Mange anti-resorptive inhibitorer inkludert bisfosfonater, kalsitonin, østrogen og selektive østrogenreseptormodulatorer har blitt brukt til å behandle osteoporose. Disse inhibitorene opprettholder benmassen ved å hemme osteoklastfunksjonen [6]. Østrogenerstatningsterapi er den mest populære behandlingen for å forebygge og behandle postmenopausal osteoporose. Imidlertid kan langvarig østrogenerstatningsterapi øke risikoen for endometrie- og brystkreft. Derfor har mange etterforskere fokusert sin innsats på å utvikle et nytt anti-resorptivt middel som ikke har bivirkninger [7–10]. Fordi osteoklaster fungerer i benresorpsjon, har spesifikt hemmende osteoklaster blitt ansett som hovedmålet i en rekke studier.
Osteoklaster er multinukleære gigantiske celler dannet av mononukleære stamceller fra monocytt/makrofagefamilien via sekvensiell proliferasjon, differensiering og fusjon av hematopoietiske forløperceller [11]. Makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) er essensielle faktorer for osteoklastdifferensiering [12]. I tillegg bidrar flere inflammatoriske cytokiner, som tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin (IL)-1b, til osteoklastogenese ved å modulere induksjonen av RANKL, osteoprotegerin og M-CSF [7,13]. RANKL-binding til celleoverflaten RANK-reseptoren resulterer i RANKL/RANK/TNFR-assosierte faktorer (TRAF)-komplekser som sekvensielt aktiverer NF-kB og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), inkludert c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase og ekstracellulær signalrelatert kinase (ERK) [14]. Denne aktiveringen spiller en nøkkelrolle i å formidle osteoklastdifferensiering, aktivering og overlevelse. RANKL aktiverer også ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer som en nukleær faktor av aktiverte T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) og c-Fos, som er essensielle for osteoklastutvikling [7,9]. Derfor regnes RANKL-signalering som hovedmålet for anti-resorptive midler som undertrykker osteoklastaktivering og bentap.
Acteosider den viktigste aktive forbindelsen til Rehmannia glutinosa, som brukes mye i tradisjonell orientalsk medisin [15,16]. Acteosid er en sterk antioksidant og har antihepatotoksiske, antiinflammatoriske og antinociseptive aktiviteter [17–20]. Vi har tidligere funnet at akteosid reduserer tyrosinaseaktivitet og melaninbiosyntese ved å regulere ERK-signalering [21], beskytter mot reaktive oksygenarter (ROS)-mediert gingivalskade [22], og undertrykker mykotoksin-mediert celleskade [23]. Disse effektene er nært knyttet til nukleosidenes evne til å fjerne ROS og regulere MAPK-mediert signalering. Spesielt er ROS foreslått for å formidle RANKL-induserte signalveier og cellulære hendelser i osteoklaster. Forbehandling med antioksidanter hemmet RANKL-indusert aktivering av NF-kB, ERK og IkBa, og undertrykte derved osteoklastogenese [24]. Disse funnene antydet sterkt at, i tillegg til anti-inflammatorisk aktivitet, er antioksidantaktivitet avgjørende for et anti-resorptivt middel, og dermed kan acteosid undertrykke RANKL-indusert osteoklastogenese.
I denne studien undersøkte vi om acteosid har en terapeutisk effekt på bentap. Vi undersøkte effekten av akteosid på osteoklastdifferensiering og benresorpsjon og de relaterte cellulære mekanismene ved å bruke in vitro og in vivo eksperimentelle systemer.
Cistanche acteosid undertrykker RANKL-indusert osteoklastogenese
Materialer og metoder
Etikkerklæring
Dyrepleie og brukspraksis ble godkjent av Chonbuk National University Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (tillatelsesnr. CBU 2010-0007). Alle eksperimenter i denne studien ble utført i henhold til retningslinjene fra dyrepleie- og brukskomiteen ved universitetet.
Mus, kjemikalier og laboratorievarer
Fire uker gamle ICR hunnmus ble kjøpt fra Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) og holdt ved 2261uC og 5565 prosent fuktighet i en 12 timers lys/mørke syklus med fri tilgang til mat og vann. Akteosid (3,4-dihydroksy-bfenetyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-kaffeoyl-bD-glukopyranosid; C29H36O15) (Fig. S1) ble isolert fra bladene til Rehmannia glutinosa. Acteosid ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) før bruk. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 og M-CSF ble kjøpt fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antistoffer spesifikke for c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa og b-actin ble hentet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antistoffer for p-p38 og p38 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Calcium Assay og Osteocalcin (OC) EIA-sett ble kjøpt fra henholdsvis BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) og Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), for å bestemme biokjemiske serumparametere. Muse-tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) analysesett (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) ble også brukt for å måle TRAP5b-nivået i serum. Med mindre annet er spesifisert, ble ytterligere kjemikalier hentet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), og laboratorievarer var fra SPL Life Sciences (Pochun, Sør-Korea).
Cellekulturer
Benmargsceller ble oppnådd fra tibiae og femora av 6 uker gamle hunn-ICR-mus i henhold til metoder beskrevet tidligere [25]. Benmargssuspensjonen ble inkubert i en 100-mm kulturskål i nærvær av 50 ng/ml M-CSF. Etter 3 dager ble adherente celler brukt som benmargsmakrofager (BMM) for å indusere osteoklastisk differensiering. Noen benmargsceller ble også inkubert i 48 timer uten M-CSF, og adherente celler ble dyrket i et osteoblastdifferensieringsmedium, som beskrevet andre steder [25]. RAW264.7 makrofagceller ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og antibiotika. Disse cellene ble brukt som en motpartscellelinje for BMMer for å utforske effekten av acteosid på osteoklastogenese.
Osteoklastisk differensiering og TRAP-farging
BMMer ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner (0–50 mM) avakteosidi 2 timer før stimulering med 100 ng/ml RANKL. Kulturmedier ble erstattet med ferske medier på dag 2 og 5. Etter 7 dagers inkubering ble kulturene fiksert i 4 prosent PBS-bufret paraformaldehyd og farget med TRAP ved bruk av et Sigma Aldrich-sett i henhold til produsentens instruksjoner. TRAP-positive celler ble talt ved hjelp av optisk mikroskopi, og celler som inneholdt 3 eller flere kjerner ble ansett for å være osteoklaster. RAW 264.7-celler ble også eksponert for 100 ng/ml RANKL etter forbehandling med akteosid i 2 timer, og etter 7 dagers inkubering ble cellene behandlet for TRAP-farging.
Måling av cellelevedyktighet
Cellelevedyktighet ble bestemt ved bruk av vannløselig tetrazoliumsalt (WST)-8-reagens. Kort fortalt ble BMM-er eller RAW264.7-celler dyrket i et vekstmedium inneholdende 10 prosent FBS og antibiotika behandlet med 10 mM akteosid eller en fenolforbindelse som quercetin, luteolin, apigenin eller epigallocatechin-3-gallat (EGCG). WST-8-reagens ble tilsatt i kulturene etter 48 timers inkubering. Etter inkubering i ytterligere 4 timer, ble den WST-8--spesifikke absorbansen målt ved 450 nm ved bruk av en mikroplateleser (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).
Benresorpsjonsanalyse
BMM-er (16105 celler/ml) ble suspendert i a-MEM som inneholdt 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL, deretter delt over en 24-brønnplate belagt med kalsiumfosfat-nanokrystaller (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Sør-Korea) ved en tetthet på 26104 celler/cm2 med og uten akteosid. Etter inkubering i 7 dager ble cellene fjernet fra platene med 5% natriumhypokloritt, og gropdannelse ble observert under et optisk mikroskop. Det resorberte området ble også målt med en bildeanalysator og uttrykt som en prosentandel av kontrollverdien.
Western blot-analyse
Hele proteinlysater ble fremstilt i en lyseringsbuffer som beskrevet andre steder [26]. Cytosoliske og nukleære proteiner ble fremstilt som beskrevet tidligere [25]. Like mengder proteinekstrakt ble separert med 12–15 prosent SDS-PAGE og blottet på polyvinyldifluoridmembraner. Blottene ble probet med primære antistoffer over natten ved 4uC før inkubering med sekundært antistoff i blokkeringsbuffer i 1 time. Blottene var
utviklet med forbedret kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Storbritannia) og eksponert for røntgenfilm (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
MAPK aktivitetsanalyse
Celler ble forbehandlet medakteosidi 2 timer og deretter stimulert med RANKL i ytterligere -30 min. MAPK-aktiviteter ble bestemt ved å bruke immunometriske analysesett, slik som p-p38 kinaseanalysesettet (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK enzymanalysesett (Assay Designs) og p-SAPK/JNK sandwich ELISA-sett (Cell Signaling Technology, MA, USA). Alle prosedyrer fulgte produsentens instruksjoner, og absorbansen ble målt med en mikroplateleser.
Elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA)
DNA-proteinbindingsreaksjoner ble utført i 30 minutter ved romtemperatur, med 10–15 mg protein i 20 ml buffer inneholdende 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 prosent glyserol , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30,000 cpm av [a-32P] dCTP-merkede oligonukleotider og Klenow-fragmentet av DNA-polymerase. Prøvene ble separert på 6 prosent polyakrylamidgeler, som ble tørket og eksponert for røntgenfilm (Eastman Kodak Co.) i 12–24 timer ved 270uC. Oligonukleotidprimersekvensene spesifikke for NF-kB var 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 og 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
NF-kB Luciferase-analyse
RAW264.7 makrofager i 24-brønnplater ble transfektert med 0,8 mg kB-luciferase reportervektor ved bruk av 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. 24 timer etter transfeksjon ble cellene stimulert med RANKL i nærvær og fravær av acteosid i 24 timer. Celler ble resuspendert i 100 ml reporterlysebuffer
(Promega, Madison, WI, USA). Like mengder proteinprøver ble plassert i 96-brønnmikroplater og blandet med luciferasesubstrat. Luminescens ble målt ved å bruke et mikroplate-luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). I dette eksperimentet ble et permeabelt NF-kB-hemmerpeptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) brukt som en positiv kB-hemmer.
Måling av cytokiner
BMM-er eller RAW264.7-celler ble stimulert med RANKL i nærvær av akteosid i 24-brønnkulturplater. Etter 48 timers inkubering ble kultursupernatanter samlet og vurdert ved ELISA ved bruk av TNF-a-, IL-1b- og IL-6-spesifikke OptEIATM-sett i henhold til produsentens instruksjoner.
Sanntids omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
mRNA-ekspresjonen av osteoklastiske markører, som c-Fos, NFATc1 og TNF-a, ble bestemt ved sanntids RT-PCR. Kort fortalt ble total-RNA ekstrahert fra makrofager med Trizol-reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). cDNA ble syntetisert med 1 mg totalt RNA ved bruk av SuperScript Revers Transcriptase II og primere (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ble brukt til å oppdage akkumulering av PCR-produkt under sykling med ABI 7500 sekvensdeteksjonssystemet (Applied Biosystems). Etter denaturering ved 95uC i 10 minutter var PCR
utført ved bruk av førti 3-trinnssykluser med denaturering ved 95uC i 15 sek, annealing ved 60uC i 1 sek, og forlengelse ved 72uC i 30 sek. Alle PCR-reaksjoner ble utført minst i triplikat, og ekspresjonsnivåene ble normalisert til husholdningsgenet HPRT i samme reaksjon. Denne studien brukte de samme primersekvensene beskrevet andre steder [7].
Måling av intracellulær ROS
En stamløsning av 29,79-diklordihydrofluorescein-diacetat (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) ble fremstilt i DMSO og lagret ved 220uC i mørket. Kort fortalt ble BMM-er (106 celler/ml i 6-brønnplater) dyrket med 50 ng/ml M-CSF i 24 timer og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0–10 mM) avakteosid2 timer før stimulering med 100 ng/ml RANKL. Etter 1 time med co-inkubering ble disse cellene deretter inkubert med 25 mM DCFH-DA i 30 minutter. Den grønne fluorescensen til 29,79-diklorfluorescein (DCF) ble registrert ved 515 nm (FL 1) ved bruk av et FACS VantageH-system (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), og 10,000 hendelser ble talt per prøve.
Induksjon av ovariektomi-indusert osteoporose
ICR-hunnmus (6 uker gamle) ble brukt til denne studien. Mus fikk en falsk operasjon (Sham, n =10) eller kirurgisk ovariektomisert (OVX, n=20) under anestesi. En uke etter operasjonen ble OVX-musene tilfeldig delt inn i 2 grupper på 10 mus hver: bilateral OVX og bilateral OVX supplert med 200 ml
PBS som inneholder 1 mM akteosid oralt (AC-gruppe). Oralt akteosid ble administrert en gang hver tredje dag i 8 uker etter operasjonen, og
samme mengde PBS ble administrert til Sham- og OVX-gruppene. Etter 1 dag etter siste administrering ble mus avlivet og deretter ble biokjemiske parametere i serum og 3-dimensjonal benstruktur analysert.
Bestemmelse av serum biokjemiske parametere
Blodprøver ble tatt via hjertepunktur og serum ble samlet ved sentrifugering. Serumprøver ble lagret ved 280uC for analyser av biokjemiske parametere. Serumnivåene av IL-1b og IL-6 ble estimert ved å bruke ELISA-settet som beskrevet ovenfor, mens alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet ble bestemt ved å bruke en biokjemisk kolorimetrisk analyse som måler mengden p -nitrofenol produsert fra et p-nitrofenolfosfatsubstrat, som beskrevet andre steder [27]. For å estimere biomarkørene for bendannelse og resorpsjon, ble serum-OC, kalsium og TRAP5b-nivåer også bestemt i henhold til produsentens instruksjoner.
Analyser av beinstruktur og morfometriske parametere
Lårbenet til mus (Sham-, OVX- og AC-grupper) ble dissekert og fylt med fysiologisk saltvann for mekanisk testing. Den mekaniske styrken til lårbenet ble målt som beskrevet andre steder [28]. Bruddbelastningen ble registrert som toppkraften i newton på det punktet som midtskaftet til høyre lårbensbrudd. I tillegg ble det lette lårbenet til hvert dyr histomorfometrisk analysert ved bruk av et mikrodatamattomografi (micro-CT) system (SkyScan 1076 mikrofokus røntgensystem, Kontich, Belgia). Kort fortalt ble beinene i 4 prosent formaldehydlagring tørket overfladisk på papirvev før de ble pakket inn i plast-''klamefilm'' eller i parafilm, for å forhindre tørking under skanning. Hvert plastinnpakket bein ble plassert i plast/polystyrenskumrør som ble montert vertikalt horisontalt i 1076 skannerprøvekammeret for
mikro-CT-avbildning. Skanning ble utført ved bruk av 100 kV kildespenning og 140 mA kildestrøm med 35 mm oppløsning.
Tredimensjonale modeller av de trabekulære beinene i lårbenet ble rekonstruert ved bruk av SkyScan CT Analyzer versjon 1.11. De strukturelle parametrene som trabekulær benmineraltetthet (BMD, g/cm3), prosent benvolum (benvolum (BV)/vevsvolum (TV), prosent ), tykkelse (Tb.Th, mm), separasjon (Tb.Sp) , mm), og antall (Tb.N, 1/mm) ble deretter målt.
Osteogen differensiering og mineraliseringsanalyse Benmargsceller dyrket i {{{{10}}}}brønnkulturplater ble behandlet med DAG (10 nM deksametason, 50 mM askorbinsyre og 20 mM b-glyserofosfat) i tilstedeværelse av 10 mM akteosid. Etter 2 uker med differensiering ble cellene fiksert med iskald 70 prosent (vol/vol) etanol i 1 time og farget med 0,2 prosent alizarin rød S i destillert vann i 30 minutter ved romtemperatur. Etter at cellene var avfarget og lufttørket, ble cellekulturplatene evaluert ved lysmikroskopi ved bruk av et invertert mikroskop (Nikon TS100, Japan). For å kvantifisere mengden rødt fargestoff ble flekken eluert med 10 prosent acetylpyridiniumklorid ved risting i 20 minutter og absorbansen ble målt ved 560 nm. Mengden kalsium avsatt i cellelagene ble også målt ved bruk av et Calcium C-sett (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. I tillegg ble ekspresjonen av beinspesifikke mRNA-markører, slik som run-relatert transkripsjonsfaktor -2 (Runx2), osterix, bensialoprotein (BSP) og OC bestemt ved sanntids RT-PCR. Oligonukleotidprimere av disse markørene ble designet med produktstørrelser mindre enn 200 bp ved bruk av Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) som beskrevet andre steder [27].
cistanche acteosid øker beindannelsen
Resultater
Acteosid hemmer osteoklastdannelse av makrofager på en doseavhengig måte
For å verifisere effekten av akteosid på BMM-differensiering til osteoklaster, ble cellene dyrket med forskjellige konsentrasjoner (0–20 mM) av akteosid i 7 dager i nærvær av 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL. Akteosid reduserte antall osteoklaster på en doseavhengig måte. Når cellene ble forbehandlet med 10 mM acteosid i 2 timer, sank osteoklasttallet med 43 prosent sammenlignet med celler supplert med M-CSF og RANKL (fig. 1A). Fig. 1B viser den RANKL-medierte osteoklastdifferensieringen og dens inhibering ved kombinert behandling med acteosid. I samsvar med dette resultatet reduserte akteosid-forbehandling den RANKL-stimulerte differensieringen av RAW264.7-celler og osteoklastdannelse (fig. 1C og D). Når det antiosteoklastiske potensialet til akteosid på BMM ble sammenlignet med antiosteoklastpotensialet til flere fenoliske forbindelser ved samme konsentrasjon (10 mM), viste luteolin den høyeste aktiviteten (fig. 2A). Imidlertid reduserte luteolin, quercetin eller apigenin i seg selv levedyktigheten til cellene (fig. 2B). Alle forbindelsene hemmet osteoklastisk differensiering av RAW264.7 makrofager med følgende relative aktiviteter: luteolin. quercetin=apigenin .
Cistanche acteosid hemmer osteoklast
