Den nåværende statusen for nevrobeskyttelse ved medfødt hjertesykdom del 2

De mikroskopiske bildene ble deretter utsatt for bildeberegning ved bruk av ImageJ-programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signalet til Hsp60 ble multiplisert med "x".

Hsp60 er et viktig proteinmolekyl som spiller en viktig biologisk rolle i menneskekroppen. Forskning de siste årene har vist at tilstedeværelsen av Hsp60 er nært knyttet til menneskelig hukommelse.

Hsp60 er et molekylært chaperonprotein som hovedsakelig er involvert i proteinfolding, utfolding, stabilisering og nedbrytning. Disse prosessene er svært viktige for normal metabolisme og cellulær funksjon i menneskekroppen. Samtidig har Hsp60 også antioksidant-, anti-inflammatoriske og immunmodulerende effekter, og spiller en stor rolle i å opprettholde menneskers helse og balansen i immunsystemet.

Forskning har funnet at Hsp60 spiller en avgjørende rolle i minnedannelse og vedlikehold. Under prosessen med læring og hukommelse produserer hjerneceller et stort antall Hsp60-molekyler. Disse molekylene kan beskytte cellene mot forstyrrelser og skade fra det ytre miljøet for å sikre jevn fremgang av læring og hukommelse. I tillegg kan Hsp60 også påvirke menneskelig tenkning og atferd ved å endre signaloverføringen til hjerneceller og utviklingen av nevroner og har en positiv innvirkning på kognisjon og stressmotstand.

Selv om rollen til Hsp60 har vist positive effekter på menneskekroppen, må folk også innse at både overskudd og mangel på Hsp60 kan ha negative effekter på menneskers helse. Derfor bør vi aktivt utforske og studere mekanismen til Hsp60 i ulike fysiologiske og patologiske tilstander i menneskekroppen for bedre å forstå posisjonen og rollen til Hsp60 i menneskers helse. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig, fordi Cistanche deserticola har antioksidant-, anti-inflammatoriske og antialdringseffekter, som kan bidra til å redusere oksidasjon og inflammatoriske reaksjoner i hjernen, og dermed beskytte helsen til nervesystemet. I tillegg kan Cistanche deserticola også fremme vekst og reparasjon av nerveceller, og dermed forbedre tilkoblingen og funksjonen til nevrale nettverk. Disse effektene kan bidra til å forbedre hukommelsen, læreevnen og tenkehastigheten, og kan også forhindre utvikling av kognitiv dysfunksjon og nevrodegenerative sykdommer.

Klikk på Know for å forbedre korttidshukommelsen

"x"-verdien ble bestemt som følger: subtrahering av det "x"-foldede Hsp60-signalet fra mitokondrie-DNA-signalet i kontrollgruppen gjorde at mitokondriell DNA-verdi var mindre enn eller lik null. Signalet til histon H2B ble multiplisert med "y".

"y"-verdien ble bestemt som følger: subtrahering av det "y"-foldede histon-H2B-signalet fra nukleær-DNA-signalet i kontrollgruppen gjorde at nukleær-DNA-verdien ble mindre enn eller lik null. Hvis bakgrunnssignalet blir høyt fra multiplikasjonen, kan kontrasten til det multipliserte bildet justeres for de samme forholdene i alle prøvene.

Bildet av dsDNA-farging, minus det justerte bildet av multiplisert Hsp60 og histon H2B, ble brukt for påfølgende analyse. Ved å bruke "Adjust-Threshold"-funksjonen ble disse bildene binarisert. Vi valgte dsDNA-puncta i størrelse fra 2 til 2 0 µm2 (sirkularitet 0,1–1,0), og de ble talt ved å bruke funksjonen "Analyser-analysere partikler".

2.3. Elektronmikroskopi

En dag før transfeksjon ble HeLa-celler belagt med en tetthet på 600 celler/µL. Uttrykket av gener av interesse ble dempet i HeLa-celler ved å bruke Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) i Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner (med en endelig RNA-konsentrasjon på 10 nM).

Fire dager etter siRNA knockdown ble cellene utsatt for fiksering. Cellekulturprøver ble fiksert med 2 % PFA og 2 % glutaraldehyd i 0.1 M fosfatbuffer, pH 7,4, ved 37 ◦C, deretter plassert i en 4 ◦C kjøleskap i 30 min. Prøvene ble fiksert i 2 % glutaraldehyd i 0.1 M fosfatbuffer over natten ved 4 ◦C. Prøvene ble vasket tre ganger med 0,1 M fosfatbuffer i 30 minutter og etterfiksert med 2 % osmiumtetroksid i 0,1 M fosfatbuffer ved 4 ◦C i 1 time.

Prøvene ble dehydrerte ingraderte etanolløsninger, overført til harpiks (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japan), og polymerisert ved 60 ◦C i 48 timer. De polymeriserte harpiksene ble kuttet i ultratynne 70-nmseksjoner med en diamantkniv ved bruk av en ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og ble deretter montert på kobbergitter.

Seksjonene ble farget med 2% uranylacetat ved romtemperatur i 15 minutter og vasket med destillert vann, etterfulgt av sekundærfarging med en blyfargingsløsning (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) ved romtemperatur i 3 minutter.

Gitteret ble observert under et transmisjonselektronmikroskop (JEM-1400Plus, JEOL Ltd.., Tokyo, Japan) ved en akselerasjonsspenning på 80 kV (sebrafiskhjerne) eller 100 kV (celle), og bildene ble tatt opp med et ladekoplet enhet (CCD) kamera (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Immunelektronmikroskopi

Prøvene på gullskivene ble frosset i flytende propan ved -175 ◦C. Etter at prøvene var frosset, ble de fryse-substituert med 1 % garvesyre i etanol og 2 % destillert vann ved -80 ◦C i 24 timer.

Prøvene ble deretter holdt ved -20 ◦C i 4 timer, etterfulgt av inkubering ved 4 ◦C i 1 time. Deretter ble prøvene dehydrert i vannfri etanol 3 ganger i 30 minutter. hver gang, etterfulgt av infiltrering med en 50:50 blanding av etanol og harpiks (LR white: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) ved 4 ◦C i 1 time. Prøvene ble overført til fersk 100 % harpiks og inkubert ved 4 ◦C i 30 minutter, og denne prosessen ble gjentatt tre ganger.

Prøvene ble overført til fersk 100 % harpiks og ble polymerisert ved 50 ◦ CO/N. De polymeriserte harpiksene ble ultratynne seksjonert ved 90 nm med en diamantkniv ved bruk av en ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica), og seksjonene ble plassert på nikkelgitter. Gitteret ble inkubert med anti-dsDNA-antistoff (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) i 1 % BSA/PBS ved 4 ◦CO/N, etterfulgt av tre skyllinger med 1 % BSA/PBS i 1 min hver.

De ble deretter inkubert med dette sekundære antistoffet konjugert til {{0}}nm gullpartikler (geit anti-mus IgG polyklonalantistoff) i 2 timer ved RT. Etter skylling med PBS ble gitteret plassert i 2% glutaraldehydein 0,1 M kakodylatbuffer.

Etterpå ble gitteret tørket og deretter farget med 2 % uranylacetat i 15 minutter og med en blyfargeløsning (Sigma-Aldrich) ved RT i 3 minutter. Gitteret ble observert gjennom et transmisjonselektronmikroskop (JEM-1400 pluss; JEOLLtd.) ved en akselerasjonsspenning på 100 kV. Digitale bilder ble tatt med et CCD-kamera (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Resultater

3.1. Redusert TFAM eller GBA induserer en økning i ektopisk mitokondrielt DNA

Først viste vi et eksempel på påvisning av mitokondrie-avledet cytoplasmatisk DNA i HeLa-celler der TFAM-proteinet ble slått ned av siRNA (Figur 1A). TFAM er en nøkkelmitokondriell transkripsjonsfaktor og fungerer også i mitokondriell DNA-replikasjon og reparasjon [20] .

Sekvenspolymorfismer i dette genet er rapportert å være assosiert med Parkinsons sykdom [21,22]. Etter 3 dager med TFAM-proteinknockdown ble det oppdaget mange dobbelttrådete DNA-prikker i cytoplasmaet til HeLa-cellene.

Histoner er positive markører for kjernefysisk opprinnelse DNA i cytoplasma, og negative markører for mitokondriell DNA og mitokondriell opprinnelse DNA i cytoplasma [23]. Disse prikkene samlokaliserte seg ikke med histoner, noe som tyder på at de ikke var kjernefysisk avledet DNA. Videre ble noen av disse cytoplasmatiske, ektopiske DNA-punktene ikke samlokalisert med Hsp60, en markør for mitokondriematrisen, noe som indikerer at de bodde utenfor mitokondriene (figur 1B, C).

Elektronmikroskopi viste også at ektopisk DNA lekket fra mitokondriene (Figur 2A, B). Oppsummert skyldtes økningen i ektopiske DNA-dots i cytoplasmaet ved TFAM-knockdown av mitokondrielt DNA som lekker fra mitokondriene. For det andre viste vi et annet eksempel på påvisning av mitokondrie-avledet cytoplasmatisk DNA i HeLa-celler der GBA-protein ble slått ned av siRNA (Figur 1A).

GBA er det forårsakende genet for Gauchers sykdom, men en heterozygot mutasjon av GBA er også en risikofaktor for Parkinsons sykdom [24]. Mange dobbelttrådete DNA-prikker ble påvist i cytoplasmaet til HeLa-cellene etter 3 dager med GBA-protein knockdown. Noen DNA-punkter ble samlokalisert med histoner, noe som tyder på at de var kjernefysisk-avledet DNA.

Andre DNA-punkter ble ikke samlokalisert med histoner, noe som tyder på at de ikke var kjernefysisk-avledet DNA, men mitokondrier-avledet DNA (figur 1D). Oppsummert skyldtes økningen i ektopiske DNA-prikker i cytoplasmaet ved GBA-nedbrytning i det minste delvis mitokondrielt DNA som lekker fra mitokondriene.

For more information:1950477648nn@gmail.com