Entydig NMR-strukturbestemmelse av (pluss)-katekin—laccase dimeriske reaksjonsprodukter som potensielle markører for drue- og vinoksidasjon

For mer informasjon, kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:( pluss )-Catechin—laccaseoksidasjondimere standarder ble hemi-syntetisert ved bruk av laccase fra Trametes. Versicolor er en vann-etanol-løsning ved pH 3,6. Åtte fraksjoner tilsvarende åtte potensielle oksidasjonsdimere produkter ble påvist. Fraksjonsprofilene ble sammenlignet med profiler oppnådd med to andre oksidoreduktaser:polyfenoloksidaseutvunnet fra druer og lakkase fra Botrytis cinerea. Profilene var svært like, selv om noen mindre forskjeller antydet mulige ulikheter i reaktiviteten til disse enzymene. Fem fraksjoner ble deretter isolert og analysert ved 1D og 2D NMR-spektroskopi. Tilsetning av spor av kadmiumnitrat i prøvene oppløst i aceton førte til fullstendig oppløste NMR-signaler av fenoliske protoner, noe som muliggjorde entydig strukturell bestemmelse av seks reaksjonsprodukter, en av fraksjonene som inneholder to enantiomerer. Disse produktene kan videre brukes som oksidasjonsmarkører for å undersøke deres tilstedeværelse og utvikling i vin under vinproduksjon og vinaldring.

Nøkkelord: oksidasjonsmarkør;( pluss )-katekin; fenoliske NMR-signaler; laccase; kadmiumnitrat; polyfenoloksidase

Klikk for å få mer informasjon

1. Introduksjon

Polyfenolerer en familie av kjemiske forbindelser som er mye til stede i naturen. De finnes i betydelige mengder i te [1], kakao [2,3], blåbær [4], druer [5l og fermenterte produkter som vin [6]. Som primære oksidasjonsmål J7,8], utvikler polyfenolenes kjemiske strukturer kontinuerlig. Disse endringene påvirker de organoleptiske egenskapene til mange typer mat; de er ansvarlige for fenomener som bruning av mat [9] og modifikasjoner av vins sensoriske egenskaper [10,11. I enologi finner dette oksidasjonsfenomenet sted i druer eller viner. Når det gjelder enzymatisk oksidasjon, er de viktigste enzymene som er ansvarlige for bruning oksidoreduktaser, mer presist,polyfenoloksidasefinnes i druer og laccase produsert av Botrytis cinerea [12].

Enzymatiskoksidasjonforekommer hovedsakelig i druemost, men ytterligere vinbruning kan skyldes kjemiske oksidasjonsreaksjoner |7,13]eller Botrytis cinerea laccase som kan være svært stabil under vinlagring14. To oksidasjonsenzymatiske aktiviteter kan forekomme på fenoliske substrater: monofenoloksidaseaktivitet karakterisert ved hydroksylering av en eksisterende hydroksylgruppe tilstøtende posisjon og difenoloksidaseaktivitet tilsvarende oksidasjonen av orto-dihydroksybenzener til orto-benzokinoner.

I følge Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), katalyseres disse enzymatiske aktivitetene av EC-1-klasse-enzymer som tilsvarer oksidoreduktaser. Blant dem er de tre hovedklassene av oksidoreduktaser som katalyserer polyfenoloksidasjon EC1.14.18.1 (monofenolmonooksygenase), EC1.11.1 (peroksidase/POD) og EC1.10.3 (oksidoreduktaser som virker på difenoler).

Denne siste klassen er delt inn i ulike underklasser, og to av dem fremstod som spesielt interessante for denne studien: EC1.10.3.1(polyfenoloksidase/PPO) og EC1.10.3.2 (lakkase)(Se tilleggsmaterialer figur S1).

PPO, lakkase og peroksidase er oksidoreduktasene som hovedsakelig er ansvarlige for bruning under druebehandling [13]. Bruning forårsaket av POD er ​​ubetydelig i frukt, men kan øke nedbrytningen av fenoler når det kombineres med PPO[15]. PPO er naturlig tilstede i druer og er i stand til å katalysere oksidasjon av monofenoler til katekoler og av katekoler til brune pigmenter [8,13,16]. Laccaser, som forekommer i Botrytis-infiserte druer, har et bredere virkningsspektrum|17|da de kan katalysere oksidasjonen av mange forskjellige substrater. Hovedlaccasenes oksidasjonsmål forblir 1-2 og 1-4 dihydroksybenzen.

I vin kan benzokinon produsert ved oksidasjon (PPO eller laccaser) lett gjennomgå ytterligere reaksjoner avhengig av redoksegenskaper og elektroniske affiniteter [15]. De kan enten fungere som elektrofiler og reagere med aminoderivater [18] eller fungere som oksidanter og reagere blant annet med fenoliske substrater. Avhengig av deres kjemiske konformasjon (kinon eller semi-kinon), kan benzokinon føre til forskjellige oksidasjonsreaksjonsprodukter. Ved en nøytral pH vil (pluss)-katechin oksideres til kinon på A-ringposisjon C5 eller C7 og føre til dannelse av seks mulige dimere isomerer som innebærer en kobling mellom B-ringposisjon C2', C5', eller C6' på den øvre katekinenheten og A-ringposisjonen C6 eller C8 på den nedre enheten [19,20]. Dehydrodicatechin er et velkjent produkt av denne koblingen [21]. Merkingsposisjonene til strukturene er vist i figur 1. Under sure forhold kan semi-kinonformer også være tilstede på B-ringen (posisjon OH3'eller OH4') og føre til fire mulige dimere isomerer [20,22] med den øvre katekinenheten og A-ringen til den nedre enheten (posisjon C6 eller C8). Enzymatisk oksidasjon av katekin ble undersøkt i tidligere studier [22,23], og de tilknyttede oksidasjonsproduktene ble karakterisert ved HPLC [24], men mer sjelden isolert og aldri fullstendig karakterisert ved NMR.

Målet med dette arbeidet var først å sammenligne av UHPLC-MS de dimere( plus )-katekinoksidasjonsproduktprofilene i nærvær av tre oksidoreduktaseekstrakter, dvs. PPO ekstrahert fra druer, lakkase fra soppen Botrytis cinerea som finnes i botrytiserte søte viner [14], og laccase fra Trametes Versicolor.

Det andre målet var å hemisyntetisere og karakterisere strukturene til noen dimere oksidasjonsprodukter ved NMR-spektroskopi oppnådd med laccase fra Trametes Versicolor.

2. Resultater og diskusjon

2.1. Sammenligning av Dimeric Reaction Products-profiler med tre forskjellige oksydoreduktaser og (pluss)-katekin

( pluss )-Catechin ble først oksidert i nærvær av laccase fra Trametes Versicolor ved pH 3,6 i modellvinløsningen. Etter separering av den dimere fraksjonen fra gjenværende (pluss)-katechin og andre polymerfraksjoner, ble åtte hovedfraksjoner samlet og analysert ved UHPLC-UV-MS, notert fra N1 til N8 i økende retensjonstid (tabell 1). Elektrospraymassespektrene i positiv modus viste ionetoppene [M pluss H] pluss ved m/z 579 for N1 til N6, hypotetisk tilsvarende en dimer dannet av en enkeltbinding mellom to katekinenheter, og [M pluss H] pluss ved m/577 for N7 og N8, noe som hypotetisk antyder dannelsen av en ekstra kobling.

Disse åtteoksidasjonfraksjoner ble potensielt observert etter kjemisk depolymerisering av en tanninfraksjon i tidligere arbeider [25,26] og kan muligens være de samme som allerede beskrevet av Guyot et al. [20], selv om de eksperimentelle forholdene var litt annerledes. Faktisk, i denne forrige studien ble et rå PPO-ekstrakt brukt ved pH 3 og 6 for å oppnå åtte fraksjoner. I denne studien ble tre forskjellige enzymer sammenlignet ved pH 3,6 i modellvinløsningen. Den komparative LC-MS-analysen av de viktigste oksidasjonsfraksjonene oppnådd med de tre forskjellige enzymene (laccase fra Trametes Versicolor, lac-case fra Botrytis cinerea og polyfenoloksidase ekstrahert fra druer) er presentert i tabell 2. For hver av de åtte fraksjonene, retensjonstidene var nesten identiske med de forskjellige enzymene, og lignende m/z ble bestemt med MS-analysen. Disse resultatene støtter hypotesen om at de samme fraksjonene ble oppnådd for hvert enzym, som inneholder produkter med strukturer som ligner på de hypotesene Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano og Ros Barcel6 [27] utførte også en sammenlignende studie av (pluss)-katechin-oksidasjonsproduktene med to forskjellige enzymer: peroksidase og polyfenoloksidase, begge ekstrahert fra jordbær. De konkluderte med at produktene oppnådd med de to enzymene var kvalitativt de samme. En tilleggsforbindelse kalt N4' med m/z=578 Th og Rt=15.66 min ble observert i eksperimenter med laccase fra Botrytis cinerea og ekstrahert PPO, men ikke med laccase fra Trametes Versicolor, noe som antyder mulige forskjeller i reaktivitet for disse enzymene.

2.2. Studie og optimalisering av fysisk-kjemiske parametere på 1H-NMR fenoliske og alifatiske OH-signaler

Den strukturelle karakteriseringen av procyanidindimerer kan oppnås ved NMR-analyse. Spesielt kan den nøyaktige koblingsposisjonen mellom enheter bestemmes ved å bruke HMBC og/eller ROESY korrelasjonsspektra [28,29] (figurene S2 og S3). I tilfelle av en eter-type (COC) binding, er tilordningen av hydroksylsignalprotonene nødvendig. Det kan også være avgjørende i tilfelle av CC-koblinger hvis noen alifatiske eller aromatiske protoner overlapper eller hvis noen nøkkelkorrelasjoner mangler. Imidlertid, selv i et aprotisk løsningsmiddel, fremstår hydroksylprotonene til polyfenoler ofte som brede signaler som ingen strukturell informasjon kan hentes fra [30]. Dette problemet ble foreløpig løst ved å legge til spor av

Cd(NO3)2 i prøveløsningene. Faktisk skyldes 'H brede signaler fra OH-grupper den intermolekylære utvekslingen mellom disse OH-protonene og andre protoner i løsningsmidlet eller oppløst stoff. Ved å redusere intermolekylære bindinger kan tilstedeværelsen av kadmiumnitrat i prøvene redusere disse utvekslingene, og dermed forbedre skarpheten til OH-protonsignaler.

2.2.1.Effekt av kadmiumtilsetning

Etter frysetørking ble de fem fraksjonene N2, N3, N4, N6 og N8 oppløst i aceton-dg. Deretter ble 1D proton-NMR-spektra oppnådd ved 25 grader før (figur 2A) og etter tilsetning av små mengder kadmium (figur 2B). I ren aceton-d. viste de fenoliske OH-protonene til alle fraksjoner seg som brede topper. Etter tilsetning av kadmium viste disse protonene høyoppløste signaler for fraksjonene N6 og N8, mens for fraksjonene N2, N3 og N4 var signalene bare litt skarpere. Det bør også nevnes at økning av Cd-innholdet ikke hadde noen effekt på OH-signaloppløsningen, da ingen skarphet eller bredde av topplinjebredde ble observert når påfølgende små mengder Cd ble tilsatt til prøvene (data ikke vist).

Høyt oppløste fenoliske OH-signaler fra produktene N2, N3 og N4 ble oppnådd takket være ytterligere tørking og resolubilisering (figur 2C,D).

Forskjellen i oppførsel ved Cd-tilsetning mellom fraksjonene kan forklares av styrken til molekylære interaksjoner: sterkere i tilfelle av N2, N3 og N4 sammenlignet med N6 og N8, et ytterligere trinn er nødvendig for å bryte disse bindingene.

Dette ekstra trinnet kan være nøkkeltrinnet når du bruker Cd for å oppnå høyt oppløste fenoliske OH-signaler i enhver situasjon, uansett opprinnelse til prøvene, syntesereaksjonen eller de naturlige polyfenoliske produktene.

Et tidligere arbeid som omhandler den entydige strukturelle karakteriseringen avpolyfenoldimerer som bruker høyt oppløste OH-fenoliske NMR-signaler takket være kadmiumnitrattilsetning ble publisert i 1996 [30]. Så vidt vi vet har ingen andre forskningsartikler som bruker denne metodikken blitt publisert siden den gang. Andre undersøkelser ble senere foretatt for å nå dette målet, enten ved pikrinsyredoserte tilsetninger [31] eller ved å bruke en lav oppsamlingstemperatur [32]. Dette kan forklares med det ytterligere trinnet som er nødvendig for å få en avgjørende effekt på OH-toppskarphet med Cd-tilsetning, som beskrevet ovenfor. Kadmium ser imidlertid ut til å være av stor verdi, siden høyt oppløste signaler kan oppnås uten behov for å legge til nøyaktige mengder, i motsetning til pikrinsyre- eller NMR-spektraopptak ved lave temperaturer.

2.2.2. Effekten av temperaturen

En reduksjon i temperaturen fra 25 grader C til 15 grader hadde ingen innvirkning på skarpheten til fenoliske OH- eller alifatiske OH-signaler. Ikke desto mindre tillot forskyvninger nedfelt av utskiftbare protontopper oss å skille noen overlappende fenoliske og alifatiske OH-signaler, noe som gjorde identifiseringen deres mer åpenbar (figur 3). Ved å senke temperaturen ble protonutvekslingshastigheten redusert, og man kunne forvente skarpere alifatiske OH-topper [31]. Temperaturen på 15 grader er åpenbart ikke lav nok til å oppnå godt oppløste alifatiske OH-signaler. Imidlertid tillot det oss å tydelig identifisere resonansen til to alifatiske OH-protoner i prøvene N3 og N6 og av en i prøve N8. Spekteret til prøve N2 viste også to OH alifatiske protonsignaler, som var mer å skille ved 25 grader C enn ved 15 grader (Figur 2E). I tilfellet med prøven N4 var signalene som oppsto fra alifatisk OH bare delvis synlige i spektre, enten temperaturen var satt til 25 grader eller til 15 grader C, på grunn av vedvarende overlapping (Figur 2E).

2.3. Strukturell karakterisering av de dimeriske standardene – NMR-spektrumanalyse

NMR-spektrene til fraksjonene N2, N3, N4, N6 og N8 viste at oksidasjonsproduktene var av høy renhet siden signalintensiteten til andre påviste forbindelser var mindre enn 10 prosent sammenlignet med disse produktene.

I alle spektre kan fire lH kjemiske skiftregioner som er typiske for katekinenheter skilles ut (figur 2C): signaler fra de alifatiske protonene til pyranringer (C-ringer) finnes i området fra 2,3 til 5.0 ppm, og de av de aromatiske signalprotonene til resorcinolringer (A-ringer) og katekolringer (bringer) fra henholdsvis 5,5 til 6,3 ppm og 6,3 til 7,1 ppm. OH-fenolsignalene til både A- og B-ringene viste seg fra 7,1 til 10 ppm. NMR-spektrene for begge fraksjonene viste tilstedeværelsen av distinkte signalsett av katekinenheter i et konstant intensitetsforhold: to sett med signaler ble observert i spektrene til fraksjonene N2, N3, N6 og N8 i samsvar med tilstedeværelsen av dimerer, og fire sett i N4-spektrene, som kan tilsvare én tetramer, to dimerer eller en blanding av forskjellige oligomerer, det vil si én trimer pluss én monomer. For å bestemme graden av oligomerisering av produktene tilstede i fraksjon N4, ble et 'H DOSY eksperiment utført ved bruk av en blanding som inneholdt alikvoter av både fraksjonene N4 og N2. Diffusjonskoeffisientene til alle signaler viste lignende verdier (figur 4), noe som indikerer tilstedeværelsen av to dimerer av katekin i fraksjon N4.

Takket være de fullt oppløste OH-fenolsignalene som gir pålitelige kvantitative resultater, kan typen kobling mellom katekinenhetene utledes direkte fra topparealintegrasjon. For begge fraksjoner, N3 og N6, indikerte således mangelen på én OH-fenol (tilhører enten resorcinol eller en katekolring) og mangelen på én aromatisk resorcinol-proton en interflavanisk kobling (IFL) av etertype som antydet en opposisjon i en A eller B-ring og en C6- eller C8-posisjon i en A-ring. Når det gjelder prøve N2, manglet to aromatiske protoner, en av en B-ring og en av en A-ring, noe som antyder en CA-CB IFL. 1D 'H-spekteret til fraksjon N4 viste at to protoner av B-ringen manglet, samt to protoner av A-ringen. Bindingene mellom dimerenhetene til fraksjon N4 er altså begge av CC-typene. Spektrene til fraksjon N8 var ganske forskjellige fra de fire andre. Noen signaler var typiske for katekinenheter, der tre OH-fenoler, en aromatisk A-ring og en B-ringproton manglet, samt en alifatisk OH. På den annen side er noen andre NMR-signaler atypiske for en katekinenhet: metylen med avblindede 13C kjemiske skift (~40 ppm) og en ketongruppe (~192 ppm).

Protonspinnsystemene til C-, A- og B-ringene ble bestemt ved å bruke både 'H 1D og 1H 2D TOCSY-spektra (ikke vist). To ABMX C-ring spinnsystemer (typisk for katekin) ble observert i spektrene til fraksjonene N2, N3, N6 og N8, og fire for fraksjon N4. I spektrene til fraksjonene N2, N3, N6 og N8 ble to metakoblede dubletter (J~2Hz) og en enkelt i det aromatiske A-ringområdet tildelt henholdsvis A-ringprotonene til den ikke-koblede katekinenheten og til A-ringens restproton til den av C6-eller C8-koblede katekinenheten. I spektrene til N4, på grunn av tilstedeværelsen av to dimerer, ble fire metakoblede dubletter og to singletter påvist og tildelt som beskrevet ovenfor. B-ringprotonsystemene ble også enkelt bestemt fra disse spektrene og gjorde det mulig for oss å identifisere to ABM protonspinnsystemer for dimerene til fraksjonene N3 og N6, mens ett ABM og ett AB protonspinnsystem ble påvist for dimer N2, og ett ABM og ett AM protonspinnsystemer for dimer N4. Dimeren N8 viste bare ett ABM B-rings spinnsystem som er typisk for en katekinmonomer.

2.3.1. Bestemmelse av A-ringposisjonen til IFL for dimerene til fraksjonene N2, N3, N4 og N6

Etableringen av broen lokalisert på A-ringen av dimerer (dvs. C6A- eller C8A-posisjon) krever attribusjon av det gjenværende HA-protonet til den CA-koblede katekinenheten. Takket være de høyt oppløste fenoliske OH-signalene, var et enkelt utgangspunkt identifiseringen av de to OH-fenolprotonene til de A-ringbundne enhetene, dvs. A-ringen som

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） som lett ble tilskrevet henholdsvis C7A og C8A. Når C6A og C8A er tildelt, kan det gjenværende HA-protonet direkte tilskrives HSQC-spektrene. Det ble således funnet at dette gjenværende HA-protonet var H6A for alle fraksjoner N2, N3, N4, N6. IFL mellom katekinenheter antydet dermed en C8A-posisjon for alle dimerer.

2.3.2. Fastsettelse av B-ringposisjonen til IFL

Dimerer av fraksjoner N2 og N4. Spektrene til fraksjon N2 viste to forskjellige typer B-ring protonspinnsystemer: en AMX som tilsvarer B-ringen til den ikke-koblede enheten, og en AM med en koblingskonstant på omtrent 8 Hz, karakteristisk for H6'B og H5' B av en C2'B-koblet enhet. Koblingen mellom enhetene til N2-dimeren er således C2'B-C8A. NMR-spektrene til fraksjon N4 viste også forskjellige B-spinnsystemer: to AMX, tilsvarende den ikke-koblede B-ringen, og to AXspin-systemer, begge viser koblingskonstanter på omtrent 2 Hz, som er karakteristiske for H2'B og H6' B-protoner av C5'B-koblede enheter. Tilstedeværelsen av langdistanse'H/13C-korrelasjoner mellom H6'Band C8A, som ble observert i HMBC-spektrene til de to dimerene, er i samsvar med en C5/'B-C8A-kobling (Figur 5).

Dimerer av fraksjoner N3 og N6. Spektrene til fraksjonene N3 og N6 viste tilstedeværelsen av to AMX B-ring protonsystemer og mangelen på ett OH-fenolsignal. Siden alle OHA-fenoliske protoner i dimerenhetene ble identifisert (som beskrevet ovenfor), kan det manglende OH-fenoliske signalet være enten det til OH3'B eller det til OH4'B.

OH-posisjonen (3'B eller 4'B) kan lett bestemmes gjennom ROE-korrelasjoner med henholdsvis H2'Bor H5'B, eller ved å bruke langdistanse HMBC-korrelasjoner som illustrert i figur 5.

Attribusjonen av den gjenværende OH til B-ringene ble enkelt utført ved bruk av enten HMBC- eller ROESY-korrelasjoner med lang rekkevidde, som illustrert i figur 5. Når det gjelder dimer N3, ble det observert en ROE-korrelasjon mellom H5'B og gjenværende OH. 'B av katekinenheten koblet gjennom B-ringen. Denne OH ble således identifisert som OH4'B. I tilfellet med fraksjon N6 ble gjenværende OH'B tilordnet OH3'B, siden en ROE-korrelasjon ble observert mellom denne OH og H2'B. Langdistanse HMBC-korrelasjonene er i samsvar med disse attribusjonene. Koblingsposisjonene til disse to dimerene ble deretter bestemt som følger: CO3'B-C8A og CO4'B-C8A for N3 og N6. hhv.

Fraksjon N8. Spektrumanalyse av dimeren N8 viste at en enhet av denne dimeren er katekinet med to koblingsposisjoner en A-ringen, en ved C8A og den andre i C-O7A-posisjonen, siden protonene H8A og OH7A er savnet. Den andre enheten av denne dimeren viste enestående spektrale trekk, noe som indikerer tap av B-ringens aromatisitet og tilstedeværelsen av flere koblingsposisjoner på både B- og C-ringer.

'H NMR-signalene som oppsto fra B-ringen var to dubletter ved 2,49 og 2,71 ppm, og viste en geminal kobling på ~15 Hz (12,03 ppm) typisk for en metylengruppe og en singlett ved 6,38 ppm som stammer fra et etylenisk proton. Siden disse metylen- og etylenprotonene ikke var koblet, er de sannsynligvis i posisjonene 2'B og 5'B. HIMBC-spekteret viste alle korrelasjoner, noe som tillot nøyaktige attribusjoner av disse B-ringkarbonene, som illustrert i figur 5. H2C til denne enheten ga tre korrelasjoner med B-ringkarboner: den ene er metylenkarbonet ved ~45 ppm, som dermed ble tilskrevet C2'B, og de resterende to, med karbon som resonerer ved ~90 ppm og ~162 ppm, som kan tilordnes C1'B og C6'B.H5'B ga bare sterke 3J-korrelasjoner med to kvartære karboner i denne B-ringen : den ene er karbonet tidligere tildelt C3'B(~95 ppm), og den andre, som ga resonans ved ~90 ppm, kan dermed tilskrives C1'B. Karbonet ved ~162 ppm ble deretter utledet til å være C6'B.

Tilstedeværelsen av en alifatisk OH (~5,8 ppm) i C3'B-posisjonen (~95 ppm) ble bestemt gjennom dens ROE-korrelasjon med begge H2'B-protonene. Videre ga OH3/B HMBC-korrelasjon med et kvaternært karbon ved ~192,5 ppm, karakteristisk for en ketongruppe i C4'B-posisjonen.

Skjermingen av denne C1'B på ca. 40 ppm er i samsvar med et tap av B-ringens aromatisitet. Videre er mangelen på OH ved C7A-posisjonen til den andre enheten i samsvar med en eterbinding C1'BO-C7A.

NMR-dataene viste at C-ringen til denne enheten ikke har noe OH3C. Tilstedeværelsen av en C3C-O-C3'B-binding er i samsvar med skjermingen av C3C på ca. 1,5 ppm så vel som det kjemiske skiftet av C3'B som er typisk for hemiketalkarbon (95 ppm).

Til sammen lar NMR-spektraldataene oss konkludere med at denne dimeren tilsvarer dehydrokatechin A beskrevet tidligere av Winges et al. [33] og deretter av Guyot et al.[20].

Strukturene til de seks dimere forbindelsene bestemt ved disse NMR-analysene er vist i figur 6, hvor N2, N3, N6 og N8 er rene produkter, og N4 er en blanding av to isomerer.

3. Materialer og metoder

3.1.Kjemikalier

(pluss)-katekinhydrat Større enn eller lik 98 prosent; laccase fra Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); natriumfosfat dibasisk dihydrat Større enn eller lik 98 prosent; sitronsyre (ACS-reagens, kadmiumnitrat-tetrahydrat 99,997 prosent; maursyre og Amberlite XAD7HP ble hentet fra Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Aceton-dg ble kjøpt fra Euriso-top (Saarbrüicken, Tyskland) og trifluoreddiksyre syre (TFA) fra Roth Labo (Karlsruhe, Tyskland). Vann LC-MS, acetonitril LC-MS(ACN) og metanol LC-MS (MeOH) var alle fra VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Forberedelse av modellvinløsningen

Modellvinløsningen var en etanol/vannløsning (12/88;o/o) med 0.033 M vinsyre, justert til pH 3.6 med NaOH 1 M [34].

3.3. Rå drue PPO-ekstrakter

PPO-ekstraktet ble fremstilt som beskrevet tidligere av Singleton et al. [35]. Frosne druer ble først blandet i en acetatbuffer (1,5 M, pH 5; 10 gL-I askorbinsyre). Blandingen ble deretter filtrert og sentrifugert (3000 g; 10 min). Resten ble til slutt vasket med aceton (80 prosent) og lufttørket.

3.4.Laccase fra Botrytis Cinerea

Laccase fra Botrytis cinerea ble oppnådd som beskrevet av Quijada-Morin et al. [36]. Den ble produsert fra VA612-stammen (samlet i 2005 i en vingård i Hautvillers, Champagne, Frankrike, fra Pinot Noir-kultivaren). Kort fortalt ble kulturer på fast maltgjærmedium stående i en uke ved 24 grader under blått lys. Sporene ble deretter skrapet og inokulert i en 500 mL Erlenmeyer-kolbe som inneholdt 125 mL kulturmedium (4{{30}} gL-1glukose, 7 gL{{10}}glyserol, 0,5 g·L-1L-histidin,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl,0,5gL-1 CaCl2·H2O,0,05g:L-1 FeSO4.7H2O,1,0g L-1KH2PO4 og 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Etter 3 dager med inkubasjon og 2 dager med vekst i samme tidligere medium, ble gallussyre (2 gL-1) tilsatt til forkulturene. Etter 5 dager ble det flytende mediet filtrert, og supernatanten ble underkastet tangentiell filtrering i et Quixstand-filtreringssystem (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) utstyrt med en 30 kDa-molekylvekt avskåret membranen. Konsentratet ble til slutt underkastet en diafiltrering mot destillert vann, og kun fraksjonene som ga oksidantaktivitet mot ABTS ble beholdt (-80 grad ).

3.5. Oksidasjonsprosedyre

En lakkaseløsning (1 gL-1) i fosfat-sitratbuffer ble tidligere fremstilt og tilsatt en 6 g.L-1( pluss )-katekinløsning (modellvin) for å oppnå en sluttkonsentrasjon av lakkase på { {6}}.3 gL-1. Den oppnådde løsningen ble deretter langsomt omrørt (180 rpm) ved romtemperatur i 2 timer. Konsentrasjonene ble tidligere optimalisert, og eksperimenteringen ble utført i tre eksemplarer.

3.6. Reaksjonsstopp på Resin Amberlite XAD7HP

En amber lite-kolonne ble kondisjonert med etanol (absolutt) og skylt med to kolonnevolumer milli-O vann. Det forrige laccase/(pluss)-katechin-reaksjonsmediet ble droppet på kolonnen og først eluert med to kolonnevolumer milli-Qwater [37]. Kolonnen ble deretter eluert med etanol inntil den oppsamlede fraksjon var ufarget. Bare etanolfraksjoner ble oppbevart, fordampet og lyofilisert. Pulveret ble lagret ved -80 grader inntil det ble brukt.

3.7.Renseprosedyre for den dimeriske fraksjonen ved bruk av flashkromatografi

Det lyofiliserte pulveret ble først renset ved bruk av et flashkromatografisystem puriflash430 utstyrt med en UV-detektor satt til 280 nm og en Puriflash-diol 50 um f0025-kolonne. Den binære mobile fasen besto av acetonitril (løsningsmiddel A) og metanol (løsningsmiddel B), begge surgjort med 0,1 prosent TFA. En serie injeksjoner ble utført ved en konstant strømningshastighet på 20 ml·min-1, ved bruk av følgende gradient: 100 prosent A i 4,4 minutter; 0-10 prosent B i 10 min; 10 prosent B i 5 min; 10-90 prosent B i 5 min; 90 prosent B i 3 min; 90-10 prosent B i 2 min; 10 prosent B i 10 min. Injeksjonsvolumet var 1 ml (300 mg lyofilisert pulver oppløst i 1 ml løsningsmiddel A). Tre distinkte fraksjoner ble samlet opp hver gang. Den første tilsvarte gjenværende (pluss)-katechin, og den tredje var en blanding av polyfenoler med høy molekylvekt. Den andre eluerte fraksjonen, inneholdende en blanding av dimere oksidasjonsprodukter, ble inndampet og lyofilisert før det andre rensetrinnet.

3.8. Rensingsprosedyre for oksidasjonsprodukter fra den dimeriske fraksjonen ved bruk av et semi-preparationskromatografisk system

Fraksjonen som inneholdt dimere oksidasjonsprodukter ble renset ved å bruke et semi-preparativt Bio-Rad NGC 10 mellomtrykkskromatografisystem utstyrt med en omvendt fase Varian Dynamax C18 Microsorb-kolonne (250 × 21,2 mm; 3 um). Den binære mobile fasen besto av milli-O-vann (løsningsmiddel A) og 80 prosent acetonitril, 20 prosent Milli-Q-vann (løsningsmiddel B), begge surgjort med 0,05 prosent TFA. En serie injeksjoner (300 μL) av det lyofiliserte pulveret (20 mg oppløst i 200 µl løsemiddel A og 100 µl ACN) ble utført under følgende elueringsbetingelser: 100 prosent A i 4 minutter; 0-35 prosent B på 46 min;35-100 prosent B på 2 min; 100 prosent B i 5 min. Åtte distinkte fraksjoner ble samlet hver gang, tilsvarende rene UPLC-signaler ved 280 nm. Hver fraksjon ble fordampet og lyofilisert før NMR-analyse.

3.9. Prøveforberedelse for NMR-analyse

Omtrent 1 mg av hvert lyofilisert pulver vektet i Eppendorf-rør ble løst i 500 μL aceton-dg. Deretter ble ~10 ul av en konsentrert løsning av kadmiumnitrat i aceton-d tilsatt til prøvene, og de resulterende løsningene ble overført til 5 mm NMR-rør for NMR-analyse. Et ytterligere trinn ble utført for noen prøver: etter solubilisering av de frysetørkede pulverene i aceton-dg i nærvær av spor av kadmium, ble prøvene fordampet til tørrhet og deretter resolubilisert i aceton-d uten ytterligere tilsetning av Cd.

3.10. Instrumentspesifikasjoner

UPLC-MS analyse. Reaksjonene ble overvåket ved å bruke to UPLC-MS-systemer. Den første ble brukt til å nøyaktig identifisere produkters oppbevaringstider ved å bruke en metode med lang gradient. dvs. Waters omvendt fase Ultra-High-Performance væskekromatografi koblet til massespektrometri (UHPLC-MS). Væskekromatografisystemet var en Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) utstyrt med en fotodiode array-detektor. Vi brukte en Acquity UPLC HSS T3-kolonne (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Kolonnetemperaturen var 25 grader. Den binære mobile fasen besto av 0,1 prosent maursyre i vann (løsningsmiddel A) og acetonitril (løsningsmiddel B). Separasjonen ble utført ved en konstant strømningshastighet på 0.25mL·min-1, ved bruk av følgende gradient:8-11 prosent B i 2 min; 11 prosent B i 8 min; 11-25 prosent B i 15 min;25-55 prosent Bin 5 min;55-99 prosent Bin 1 min;99 prosent B i 4 min;99-8 prosent Bin1 min;8 prosent B i 4 min. Injeksjonsvolumet var 5 μL. Massespektrometeret var en Waters Acquity QDa elektrosprayionisering (ESI) enkel kvadrupol (Waters, Milford, MA, USA). Kapillærspenningen ble satt til 0,8 kV. Massespektrene ble innhentet over et masseområde på 200-900 Tynn positiv ionemodus.

Det andre UHPLC-MS-systemet, brukt for rask verifisering under rensetrinnene, var det samme som beskrevet tidligere, med en Acquity UHPLC HSS T3-kolonne (1,8 μm, 2,1×100 mm） oppvarmet ved 38 grader. Separasjonen ble utført med en konstant strømningshastighet på 0,55 mL·min-1, ved bruk av følgende raske gradient:0.1-40 prosent B i 5 minutter; 40-99 prosent B på 2 minutter; 99 prosent B i 1 min; 99-0.1 prosent B på 1 min. Injeksjonsvolumet var 2 μL. Massespektrometeret var en Bruker Amazon X elektrosprayionisering (ESI) ionefelle (Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland). Kapillærspenningen ble satt til -5,5 kV. Massespektrene ble innhentet over et masseområde på 50-2000 Tynn positiv ionemodus.

Alle UPLC-MS-analyser ble utført i tre eksemplarer.

NMR-instrumentering. Alle NMR-spektrene ble registrert på et Agilent DD{{0}} MHz-spektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), som opererer ved 500,05 og 125,74 MHz for proton- og karbon-13-kjerner, henholdsvis ved bruk av en 5 mm indirekte deteksjonssonde utstyrt med en gradientspole.1D'H og 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY og ROESY, og heteronukleære lH/13C HSQC og HMBCeksperimenter ble utført ved bruk av klassiske pulssekvenser og analysert ved bruk av både VNMRJ4.2 og Mest2Nova. .1 (Mestrelab Research, Spania) programvare. DOSY-målinger ble innhentet og behandlet som tidligere beskrevet 38]. Innsamlingsparametrene for DgcsteSL-pulssekvensen var som følger: diffusjonsforsinkelsestiden og gradientpulsbredden ble satt til henholdsvis 50 ms og 2 ms, gradientstyrken (g) ble økt i 16 trinn med lik g2-avstand fra 0,3 til 2 ms. 32G·cm-I. Etter fasekorreksjon ble 2D DOSY-spektra konstruert fra topphøydemålingen ved bruk av VNMRJ4.2-programvare.

Alle spektre ble referert til løsningsmiddelaceton-dg-signalene ('H-restsignal ved 2,05 ppm og 13C-signal ved 29,92 ppm).

4. Konklusjoner

Virkningen av tre forskjellige oksidoreduktaser (polyfenoloksidase ekstrahert fra druer, lakkase fra Botrytis cinerea og lakkase fra Trametes Versicolor) på (pluss )-katekin ble undersøkt, og LC-UV-MS resulterende profiler var svært like, selv om noen mindre forskjeller antydet mulige ulikheter i reaktiviteten til disse enzymene.

Strukturene til seks katekin-lakkase-oksidasjonsprodukter (ved bruk av laccase fra Trametes Versicolor) ble oppnådd på grunnlag av spesifikke NMR-signaturer (fire rene produkter, dvs. N2, N3, N6 og N8, og N4, tilsvarende en blanding av to isomerer). Den fullstendige tilskrivelsen av fenoliske OH-signaler var mulig takket være tilsetningen av kadmiumnitrat med en prøveforberedelsesprosedyre som tillot den entydige tilordningen av koblingene mellom katekinenhetene for noen av forbindelsene av interesse. Denne prosedyren vil i stor grad forenkle NMR-analyse av polyfenolblandinger, enten syntetisert eller ekstrahert fra naturlige produkter.

Standardene oppnådd i dette arbeidet kan bli brukt i fremtiden som oksidasjonsmarkører for å undersøke deres tilstedeværelse og utvikling under druemodning og vinaldring. Foruten katekin, kan andre polyfenolforbindelser, inkludert flavonoider og ikke-flavonoider, også brukes som substrater for laccase for å oppnå ytterligere nye standarder.

Forkortelser

NMR: kjernemagnetisk resonans,

CD: kadmium,

TOCSY: total korrelasjonsspektroskopi,

ROESY: Nukleær Overhauser-effektspektroskopi med roterende ramme,

HSQC: heteronukleært enkeltkvantekorrelasjonseksperiment,

HMBC:heteronukleær flerbåndstilkobling,

DOSY: diffusjonsordnet spektroskopi.

Referanser

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Tea Polyphenols for Health Promotion. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Characterization of New Flavan-3-Ol-derivater i fermenterte kakaobønner. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polyfenoler fra kakao og vaskulær helse - en kritisk gjennomgang. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Konsentrasjoner av polyfenoler fra ekstrakt av blåbærrester ved bruk av nanofiltrering. Mat Bioprod. Prosess. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterisering av polyfenoler og evaluering av antioksidantkapasitet i druepester av cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Hvordan utvikler vinpolyfenoler seg under vinaldring? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Oksidasjonsmekanismer som forekommer i viner. Mat Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Oksygen med fenoler og relaterte reaksjoner i moster, viner og modellsystemer: observasjoner og praktiske implikasjoner. Er. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69–77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Food Browning som en polyfenolreaksjon. I fremskritt innen matforskning; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, red.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Bind 19, s. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evolusjon av fenoliske forbindelser og astringens under aldring av rødvin: Effekt av oksygeneksponering før og etter tapping. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]